茯磚茶中冠突散囊菌的指標要求和檢測方法分析

◎ 雷蘭蘭，舒 靜，張 曼，馮海霞，劉源博

（陜西省產品質量監督檢驗研究院，陜西 西安 710048）

涇陽茯磚茶在2013年09月26日以獨特的品質獲得原國家質檢總局“地理標志保護產品”稱號[1]，涇陽茯磚茶也被譽為“中國古絲綢之路上的神秘之茶”[2]，距今已有600多年的歷史，因其是在夏季伏天里加工制作，其香氣和作用又和茯苓相似，且蒸煮壓制后的外形呈磚狀，所以稱其為“茯磚茶”，屬于再加工茶類中黑茶緊壓茶的一種[3]。我國一千多種茶葉中，只有茯磚茶中生長繁殖有肉眼可見的金花菌，使得茯磚茶具有獨特的發酵茶風味。

除了陜西涇陽，湖南益陽（安化）也是茯磚茶的產地之一。作為湖南特色產品的茯磚茶，是由安化的茶行采購原料黑毛茶運至陜西涇陽，委托當地茶坊壓筑成茯磚茶[4]。無論是哪個產地的茯磚茶，其中均有大量不同種的微生物存在，但“金花菌”均是茯磚茶在加工筑制過程中產生的一種優勢微生物。金花菌學名為“冠突散囊菌”，其子囊殼在茯磚茶茶葉中呈現肉眼可見的金黃色顆粒，俗稱“金花”。研究表明冠突散囊菌以茶葉基質為營養成分生長，在生長代謝的過程中產生并分泌多種胞外酶，如纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶等[5]。這些酶將茶葉中的纖維素、多糖、蛋白質等各種大分子物質轉化、分解和降解成小分子物質，小分子活性物不但能夠形成茯磚茶獨特的風味品質，還使得涇陽茯磚茶具有調節血脂血糖、抗血栓、抗腫瘤和調理腸胃等方面的功效[6]。

1 茯磚茶產品標準中對冠突散囊菌指標的要求分析

我國現行有效的茯磚茶標準包括一個國家標準和兩個地方標準，分別是國家標準《緊壓茶 第3部分：茯磚茶》（GB/T 9833.3—2013）、陜西省地方標準《食品安全地方標準 涇陽茯茶》（DBS 61/0006—2021）和湖南省地方標準《安化黑茶 茯磚茶》（DB43/T 569—2010），三者對茯磚茶的定義和茯磚茶中冠突散囊菌限量值的規定如表1所示。這3個標準中規定的茯磚茶都是以黑毛茶為原料，主要的工藝過程均包括篩分、拼配、渥堆、定型、發花和干燥，最后包裝。對于冠突散囊菌的指標，因為國家標準產品覆蓋范圍廣，所以制定的冠突散囊菌指標要求最低，且未對產品質量等級進行分類，統一規定為20×104CFU·g-1。而涇陽茯磚茶因為屬于地理標志保護產品，所以對冠突散囊菌的指標要求較高，且按照產品質量等級進行分類要求，對特一級的要求是35×104CFU·g-1，對特二級和一級的要求是30×104CFU·g-1。《安化黑茶 茯磚茶》中雖然將產品質量等級分類為超級茯磚茶、特制茯磚茶和普通茯磚茶，但是對冠突散囊菌的指標要求統一為30×104CFU·g-1，且注明該指標為參考指標，所以不用于產品合格與否的判定。因此綜合來看，陜西省地方標準《食品安全地方標準 涇陽茯茶》（DBS 61/0006—2021）對冠突散囊菌的指標要求最為嚴格。

表1 茯磚茶標準中冠突散囊菌的指標要求表

2 茯磚茶標準中冠突散囊菌的檢驗方法分析

目前對茯磚茶中冠突散囊菌數量的檢測，3個標準規定的檢驗方法都是《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》（GB 4789.15—2016）中的第一法平板計數法。相較于涂布接種，該方法使用傾注接種的菌落是在培養基內部生長，不便于挑取菌落進行后續實驗。把握不好傾注融化的熱瓊脂溫度，可能會影響部分有損傷的待檢菌的生長，但傾注法的接種量是涂布接種法的10倍，因為加樣量比較大，所以加樣誤差比較小。稀釋液為無菌蒸餾水、無菌生理鹽水或者無菌磷酸鹽緩沖液，無菌蒸餾水使用簡單方便，僅需滅菌分裝即可使用，不需要額外的試劑；生理鹽水和磷酸鹽緩沖液對生物細胞有更好的保護作用[7]，生理鹽水可以給微生物細胞一個相對穩定的滲透壓，能夠防止細胞因滲透壓改變而破裂或脫水死亡；磷酸鹽具有較強的緩沖能力，可以為細胞維持一個較為穩定的pH環境，避免細胞受損害。但是生理鹽水的配制方法更簡單，試劑成本也更低。劉凱利等[8]通過響應面試驗，研究了無菌水、不同濃度的氯化鈉稀釋液和磷酸鹽緩沖液對茯磚茶中金花菌菌落總數的影響，發現當稀釋液為無菌生理鹽水時，金花菌的菌落總數計數最多。具體的操作步驟是稱取25 g固體樣品，加入225 mL無菌稀釋液，進行充分地振搖或拍打，制成10倍稀釋的樣品勻液，再繼續進行梯度稀釋。同時在進行梯度稀釋的過程中，選取2～3個稀釋度，每個稀釋度分別取1 mL的樣品稀釋液加入兩個無菌培養皿內。接著將冷卻至46 ℃的培養基約25 mL傾注于培養皿中，轉動培養皿使其混勻，置水平桌面待培養基完全凝固。瓊脂凝固后，將平板正置于（28±1）℃的培養箱中培養并觀察。培養至第5天時記錄結果，選取菌落數在10～150 CFU的平板，根據菌落形態分別計數霉菌和酵母[9]。從該過程可以看出，GB 4789.15—2016第一法平板計數法是霉菌和酵母菌的非選擇性計數檢驗方法，是否適用于茯磚茶中冠突散囊菌的計數檢測還有待于驗證。

3 茯磚茶取樣方式的討論

GB 4789.15—2016第一法中規定，對于固體樣品，稱取25 g用于制備10倍稀釋的樣品勻液。由于茯磚茶中的冠突散囊菌一般位于茶磚的中間部位，距離茶磚表面1 cm范圍內幾乎無肉眼可見金花，而茶磚因為經過壓制工藝，內部的金花也存在分布不均勻的現象，因此取樣方式的不同也會造成冠突散囊菌檢測結果有很大差異。目前常見的取樣方式為粉碎法和五點取樣法。粉碎法即為使用粉碎機將茶磚整體粉碎過篩后稱取25 g茶樣進行檢測。五點取樣法是指在茶磚對角線上距離茯磚茶四角1～3 cm處的4個點和茶磚中心點取樣，每個點取樣5 g左右。劉凱利等[8]、馬躍等[10]研究發現，使用粉碎法對茯磚茶中冠突散囊菌進行計數檢測，得到的茯磚茶中冠突散囊菌的數量為106CFU·g-1，遠遠超過國家標準法的 105CFU·g-1，且粉碎法得到的數據整體穩定性較高。但本實驗室在使用粉碎法時發現，茶磚被粉碎后形成細小的茶粉，在檢測取樣時，細小的茶粉很容易漂浮到空氣中，造成實驗室的環境污染，所以該方法不適合批量檢測。相比粉碎法，五點法操作簡單，不需要粉碎機，僅使用微生物檢測實驗室常用的無菌取樣工具即可進行取樣，但是由于金花分布的不均勻性，五點法取樣不能夠代表茶磚中冠突散囊菌的真實數量。因此，檢測冠突散囊菌時，對茯磚茶的取樣方式還需要進行研究。

4 3種培養基上冠突散囊菌的生長狀況

除了GB 4789.15—2016中規定的兩種培養基（孟加拉紅瓊脂和馬鈴薯葡萄糖瓊脂），再增加察氏瓊脂培養基，按照GB 4789.15—2016的檢驗步驟進行操作，其中稀釋液使用無菌生理鹽水，對茯磚茶中冠突散囊菌進行計數檢驗。培養至第5天時，結果如圖1所示。

圖1 3種培養基上冠突散囊菌的生長狀況圖

孟加拉紅瓊脂和馬鈴薯葡萄糖瓊脂上的冠突散囊菌菌落形態致密，呈絨毛狀，邊緣呈清晰可見的圓形，且在孟加拉紅瓊脂上是非常典型的金黃色，與培養基本身的紅色基質形成明顯的對比。而在察氏培養基上的冠突散囊菌菌落疏松，顏色暗淡，與培養基對比不夠清晰，難以計數。因此綜合考慮，孟加拉紅瓊脂為檢驗茯磚茶中冠突散囊菌的最適培養基，這也與劉相真等[11]的研究結論一致。

5 結論

雖然茯磚茶的不同產品標準中對冠突散囊菌的指標要求不同，但冠突散囊菌是評價茯磚茶質量優劣的關鍵指標，其檢測方法卻存在問題和爭議。本文分析了冠突散囊菌檢測時不同取樣方式的優缺點，描述了冠突散囊菌在3種不同培養基上的菌落形態特征，為茯磚茶中冠突散囊菌的檢驗檢測提供一定的理論基礎和實踐依據。