茯磚茶中冠突散囊菌的指標(biāo)要求和檢測(cè)方法分析

◎ 雷蘭蘭，舒 靜，張 曼，馮海霞，劉源博

（陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710048）

涇陽(yáng)茯磚茶在2013年09月26日以獨(dú)特的品質(zhì)獲得原國(guó)家質(zhì)檢總局“地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品”稱號(hào)[1]，涇陽(yáng)茯磚茶也被譽(yù)為“中國(guó)古絲綢之路上的神秘之茶”[2]，距今已有600多年的歷史，因其是在夏季伏天里加工制作，其香氣和作用又和茯苓相似，且蒸煮壓制后的外形呈磚狀，所以稱其為“茯磚茶”，屬于再加工茶類(lèi)中黑茶緊壓茶的一種[3]。我國(guó)一千多種茶葉中，只有茯磚茶中生長(zhǎng)繁殖有肉眼可見(jiàn)的金花菌，使得茯磚茶具有獨(dú)特的發(fā)酵茶風(fēng)味。

除了陜西涇陽(yáng)，湖南益陽(yáng)（安化）也是茯磚茶的產(chǎn)地之一。作為湖南特色產(chǎn)品的茯磚茶，是由安化的茶行采購(gòu)原料黑毛茶運(yùn)至陜西涇陽(yáng)，委托當(dāng)?shù)夭璺粔褐绍虼u茶[4]。無(wú)論是哪個(gè)產(chǎn)地的茯磚茶，其中均有大量不同種的微生物存在，但“金花菌”均是茯磚茶在加工筑制過(guò)程中產(chǎn)生的一種優(yōu)勢(shì)微生物。金花菌學(xué)名為“冠突散囊菌”，其子囊殼在茯磚茶茶葉中呈現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的金黃色顆粒，俗稱“金花”。研究表明冠突散囊菌以茶葉基質(zhì)為營(yíng)養(yǎng)成分生長(zhǎng)，在生長(zhǎng)代謝的過(guò)程中產(chǎn)生并分泌多種胞外酶，如纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶等[5]。這些酶將茶葉中的纖維素、多糖、蛋白質(zhì)等各種大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化、分解和降解成小分子物質(zhì)，小分子活性物不但能夠形成茯磚茶獨(dú)特的風(fēng)味品質(zhì)，還使得涇陽(yáng)茯磚茶具有調(diào)節(jié)血脂血糖、抗血栓、抗腫瘤和調(diào)理腸胃等方面的功效[6]。

1 茯磚茶產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)冠突散囊菌指標(biāo)的要求分析

我國(guó)現(xiàn)行有效的茯磚茶標(biāo)準(zhǔn)包括一個(gè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和兩個(gè)地方標(biāo)準(zhǔn)，分別是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《緊壓茶 第3部分：茯磚茶》（GB/T 9833.3—2013）、陜西省地方標(biāo)準(zhǔn)《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 涇陽(yáng)茯茶》（DBS 61/0006—2021）和湖南省地方標(biāo)準(zhǔn)《安化黑茶 茯磚茶》（DB43/T 569—2010），三者對(duì)茯磚茶的定義和茯磚茶中冠突散囊菌限量值的規(guī)定如表1所示。這3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的茯磚茶都是以黑毛茶為原料，主要的工藝過(guò)程均包括篩分、拼配、渥堆、定型、發(fā)花和干燥，最后包裝。對(duì)于冠突散囊菌的指標(biāo)，因?yàn)閲?guó)家標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品覆蓋范圍廣，所以制定的冠突散囊菌指標(biāo)要求最低，且未對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量等級(jí)進(jìn)行分類(lèi)，統(tǒng)一規(guī)定為20×104CFU·g-1。而涇陽(yáng)茯磚茶因?yàn)閷儆诘乩順?biāo)志保護(hù)產(chǎn)品，所以對(duì)冠突散囊菌的指標(biāo)要求較高，且按照產(chǎn)品質(zhì)量等級(jí)進(jìn)行分類(lèi)要求，對(duì)特一級(jí)的要求是35×104CFU·g-1，對(duì)特二級(jí)和一級(jí)的要求是30×104CFU·g-1。《安化黑茶 茯磚茶》中雖然將產(chǎn)品質(zhì)量等級(jí)分類(lèi)為超級(jí)茯磚茶、特制茯磚茶和普通茯磚茶，但是對(duì)冠突散囊菌的指標(biāo)要求統(tǒng)一為30×104CFU·g-1，且注明該指標(biāo)為參考指標(biāo)，所以不用于產(chǎn)品合格與否的判定。因此綜合來(lái)看，陜西省地方標(biāo)準(zhǔn)《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 涇陽(yáng)茯茶》（DBS 61/0006—2021）對(duì)冠突散囊菌的指標(biāo)要求最為嚴(yán)格。

表1 茯磚茶標(biāo)準(zhǔn)中冠突散囊菌的指標(biāo)要求表

2 茯磚茶標(biāo)準(zhǔn)中冠突散囊菌的檢驗(yàn)方法分析

目前對(duì)茯磚茶中冠突散囊菌數(shù)量的檢測(cè)，3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢驗(yàn)方法都是《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》（GB 4789.15—2016）中的第一法平板計(jì)數(shù)法。相較于涂布接種，該方法使用傾注接種的菌落是在培養(yǎng)基內(nèi)部生長(zhǎng)，不便于挑取菌落進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。把握不好傾注融化的熱瓊脂溫度，可能會(huì)影響部分有損傷的待檢菌的生長(zhǎng)，但傾注法的接種量是涂布接種法的10倍，因?yàn)榧訕恿勘容^大，所以加樣誤差比較小。稀釋液為無(wú)菌蒸餾水、無(wú)菌生理鹽水或者無(wú)菌磷酸鹽緩沖液，無(wú)菌蒸餾水使用簡(jiǎn)單方便，僅需滅菌分裝即可使用，不需要額外的試劑；生理鹽水和磷酸鹽緩沖液對(duì)生物細(xì)胞有更好的保護(hù)作用[7]，生理鹽水可以給微生物細(xì)胞一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的滲透壓，能夠防止細(xì)胞因滲透壓改變而破裂或脫水死亡；磷酸鹽具有較強(qiáng)的緩沖能力，可以為細(xì)胞維持一個(gè)較為穩(wěn)定的pH環(huán)境，避免細(xì)胞受損害。但是生理鹽水的配制方法更簡(jiǎn)單，試劑成本也更低。劉凱利等[8]通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)，研究了無(wú)菌水、不同濃度的氯化鈉稀釋液和磷酸鹽緩沖液對(duì)茯磚茶中金花菌菌落總數(shù)的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)稀釋液為無(wú)菌生理鹽水時(shí)，金花菌的菌落總數(shù)計(jì)數(shù)最多。具體的操作步驟是稱取25 g固體樣品，加入225 mL無(wú)菌稀釋液，進(jìn)行充分地振搖或拍打，制成10倍稀釋的樣品勻液，再繼續(xù)進(jìn)行梯度稀釋。同時(shí)在進(jìn)行梯度稀釋的過(guò)程中，選取2～3個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度分別取1 mL的樣品稀釋液加入兩個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)。接著將冷卻至46 ℃的培養(yǎng)基約25 mL傾注于培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使其混勻，置水平桌面待培養(yǎng)基完全凝固。瓊脂凝固后，將平板正置于（28±1）℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并觀察。培養(yǎng)至第5天時(shí)記錄結(jié)果，選取菌落數(shù)在10～150 CFU的平板，根據(jù)菌落形態(tài)分別計(jì)數(shù)霉菌和酵母[9]。從該過(guò)程可以看出，GB 4789.15—2016第一法平板計(jì)數(shù)法是霉菌和酵母菌的非選擇性計(jì)數(shù)檢驗(yàn)方法，是否適用于茯磚茶中冠突散囊菌的計(jì)數(shù)檢測(cè)還有待于驗(yàn)證。

3 茯磚茶取樣方式的討論

GB 4789.15—2016第一法中規(guī)定，對(duì)于固體樣品，稱取25 g用于制備10倍稀釋的樣品勻液。由于茯磚茶中的冠突散囊菌一般位于茶磚的中間部位，距離茶磚表面1 cm范圍內(nèi)幾乎無(wú)肉眼可見(jiàn)金花，而茶磚因?yàn)榻?jīng)過(guò)壓制工藝，內(nèi)部的金花也存在分布不均勻的現(xiàn)象，因此取樣方式的不同也會(huì)造成冠突散囊菌檢測(cè)結(jié)果有很大差異。目前常見(jiàn)的取樣方式為粉碎法和五點(diǎn)取樣法。粉碎法即為使用粉碎機(jī)將茶磚整體粉碎過(guò)篩后稱取25 g茶樣進(jìn)行檢測(cè)。五點(diǎn)取樣法是指在茶磚對(duì)角線上距離茯磚茶四角1～3 cm處的4個(gè)點(diǎn)和茶磚中心點(diǎn)取樣，每個(gè)點(diǎn)取樣5 g左右。劉凱利等[8]、馬躍等[10]研究發(fā)現(xiàn)，使用粉碎法對(duì)茯磚茶中冠突散囊菌進(jìn)行計(jì)數(shù)檢測(cè)，得到的茯磚茶中冠突散囊菌的數(shù)量為106CFU·g-1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法的 105CFU·g-1，且粉碎法得到的數(shù)據(jù)整體穩(wěn)定性較高。但本實(shí)驗(yàn)室在使用粉碎法時(shí)發(fā)現(xiàn)，茶磚被粉碎后形成細(xì)小的茶粉，在檢測(cè)取樣時(shí)，細(xì)小的茶粉很容易漂浮到空氣中，造成實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境污染，所以該方法不適合批量檢測(cè)。相比粉碎法，五點(diǎn)法操作簡(jiǎn)單，不需要粉碎機(jī)，僅使用微生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室常用的無(wú)菌取樣工具即可進(jìn)行取樣，但是由于金花分布的不均勻性，五點(diǎn)法取樣不能夠代表茶磚中冠突散囊菌的真實(shí)數(shù)量。因此，檢測(cè)冠突散囊菌時(shí)，對(duì)茯磚茶的取樣方式還需要進(jìn)行研究。

4 3種培養(yǎng)基上冠突散囊菌的生長(zhǎng)狀況

除了GB 4789.15—2016中規(guī)定的兩種培養(yǎng)基（孟加拉紅瓊脂和馬鈴薯葡萄糖瓊脂），再增加察氏瓊脂培養(yǎng)基，按照GB 4789.15—2016的檢驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，其中稀釋液使用無(wú)菌生理鹽水，對(duì)茯磚茶中冠突散囊菌進(jìn)行計(jì)數(shù)檢驗(yàn)。培養(yǎng)至第5天時(shí)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 3種培養(yǎng)基上冠突散囊菌的生長(zhǎng)狀況圖

孟加拉紅瓊脂和馬鈴薯葡萄糖瓊脂上的冠突散囊菌菌落形態(tài)致密，呈絨毛狀，邊緣呈清晰可見(jiàn)的圓形，且在孟加拉紅瓊脂上是非常典型的金黃色，與培養(yǎng)基本身的紅色基質(zhì)形成明顯的對(duì)比。而在察氏培養(yǎng)基上的冠突散囊菌菌落疏松，顏色暗淡，與培養(yǎng)基對(duì)比不夠清晰，難以計(jì)數(shù)。因此綜合考慮，孟加拉紅瓊脂為檢驗(yàn)茯磚茶中冠突散囊菌的最適培養(yǎng)基，這也與劉相真等[11]的研究結(jié)論一致。

5 結(jié)論

雖然茯磚茶的不同產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)冠突散囊菌的指標(biāo)要求不同，但冠突散囊菌是評(píng)價(jià)茯磚茶質(zhì)量?jī)?yōu)劣的關(guān)鍵指標(biāo)，其檢測(cè)方法卻存在問(wèn)題和爭(zhēng)議。本文分析了冠突散囊菌檢測(cè)時(shí)不同取樣方式的優(yōu)缺點(diǎn)，描述了冠突散囊菌在3種不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征，為茯磚茶中冠突散囊菌的檢驗(yàn)檢測(cè)提供一定的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù)。