高效液相色譜-串聯質譜法測定水產魚類中的角黃素與葉黃素

◎ 彭名軍，劉春生，毛新武，周慶瓊，戚 平，林子豪，曾豪威

（廣州市食品檢驗所，廣東 廣州 511400）

角黃素與葉黃素是類胡蘿卜素中應用較為廣泛的著色劑，具有類胡蘿卜素特有抗氧化作用[1-2]，廣泛應用于醫藥、食品、飼料等方面[3]。養殖人員可能在飼料中添加角黃素與葉黃素，特別是在產蛋禽類和有色水產品（如黃骨魚、觀賞魚）的養殖過程中添加，可改善禽類皮膚或禽蛋蛋黃的顏色和有色水產魚類皮膚的顏色，提高其商品價值。角黃素易蓄積在人體視網膜上，長期攝入會引起視網膜的損傷[4]。1995年，聯合國糧農組織和世界衛生組織聯合食品添加劑專家委員會（Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives，JECFA）制定了角黃素可接受的每日最大攝入量為0.03 mg·kg-1（按體重計）[5]。2006年，日本“肯定列表制度”規定禽蛋等動物源性食品中角黃素最大殘留量為0.1 mg·kg-1[6]。目前我國尚未對動物性食品中角黃素和葉黃素的殘留制定限量標準，但《飼料添加劑品種目錄（2013）》規定，角黃素只允許在家禽養殖過程中使用，不允許在水產養殖過程中使用。天然葉黃素允許在家禽和水產養殖過程中使用。角黃素或葉黃素的檢測方法主要有高效液相色譜法[7-13]、高效液相色譜質譜法[6]，同時測定角黃素與葉黃素的檢測方法較少。本研究采用高效液相色譜串聯質譜法，對有色魚類皮膚組織中角黃素與葉黃素的檢測方法進行研究，建立一種同時測定水產魚類中角黃素與葉黃素的測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

角黃素標準品（CAS：514-78-3），純度≥99.8%（上海安譜實驗科技股份有限公司）；葉黃素標準品（CAS：514-78-3），純度＞90%（上海源葉生物科技有限公司）；乙腈（色譜純，美國Thermo Fisher Scientific 公司）；甲醇（色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司）；乙酸（LC/MS級，美國Thermo Fisher Scientific公司）；2，6-二叔丁基對甲酚（BHT），純度≥99.0%（上海安譜實驗科技股份有限公司）。

Q Exactive? LCMS-U3000高效液相色譜-串聯質譜儀，配電噴霧離子源（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Allegra X-30R離心機（美國貝克曼公司）；旋渦振蕩混合器（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配制

角黃素標準溶液（0.1 mg·mL-1）：準確稱取2.5 mg角黃素標準品，用乙腈溶解并定容至25 mL，-20 ℃保存。

葉黃素標準溶液（0.1 mg·mL-1）：準確稱取2.5 mg葉黃素標準品，用乙腈溶解并定容至25 mL，-20 ℃保存。

0.1%BHT-乙腈溶液：準確稱取0.1 g BHT標準品，用100 mL乙腈溶解，混勻。

角黃素、葉黃素混合中間液（10 μg·mL-1）：分別準確吸取角黃素、葉黃素標準溶液各1.00 mL，用0.1%BHT-乙腈溶液定容至10 mL，混勻。

角黃素、葉黃素混合工作液：準確吸取一定體積的角黃素、葉黃素混合中間液，用0.1%BHT-乙腈溶液配制標準系列溶液，現配現用。

1.2.2 樣品處理

試樣制備：取一定量魚皮組織，切碎后混合均勻，置于-20 ℃冰箱中儲存。

樣品提?。簻蚀_稱取2.50 g樣品，加入10 mL提取溶劑0.1%BHT-乙腈，渦旋振蕩5 min，8 000 r·min-1轉速離心5 min，上清液轉移至25 mL比色管中，重復提取一次，合并提取液，用提取溶劑定容。取0.5 mL提取液至10 mL比色管，用提取溶劑定容，搖勻后過0.22 μm濾膜，上機待測。由于角黃素、葉黃素對光與溫度敏感，實驗保持在避光且溫度不超過35 ℃的環境下進行。

1.2.3 高效液相色譜-串聯質譜條件

（1）液相條件。色譜柱：Thermo Fisher Accucore aQ（150 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流動相A為0.1%乙酸水（含10%甲醇），流動相B為0.1%乙酸-甲醇；A∶B=1∶19等度洗脫；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL；流速：0.3 mL·min-1。

（2）質譜條件。采用電噴霧電離源（ESI）正離子電離模式，噴霧電壓3.5 kV，鞘氣流速45 L·min-1，輔助氣流速15 L·min-1，離子傳輸管溫度320 ℃，噴霧器溫度350 ℃，采用PRM模式，分辨率為17500。角黃素和葉黃素質譜參數見表1。

表1 角黃素、葉黃素質譜參數表

2 結果與分析

2.1 流動相的選擇

角黃素與葉黃素不溶于水，易溶于有機溶劑。本實驗分別選取甲醇、乙腈為有機相，0.1%乙酸水、5 mmol乙酸銨為水相，進行兩兩組合試驗，具體組合見表2。角黃素與葉黃素在4組流動相體系下的色譜圖見圖1和圖2。

圖1 角黃素在4組流動相體系下的色譜圖

圖2 葉黃素在4組流動相體系下的色譜圖

表2 4種流動相組合試驗表

對于角黃素，上述4種流動相的不同組合對其峰形的影響無顯著差異。對于葉黃素，使用乙腈作為有機相，相對于使用甲醇時，峰形明顯變寬，甚至出現3頭峰的情況。使用0.1%乙酸水或5 mmol乙酸銨作為水相，對葉黃素峰形的影響無顯著差異，因此選擇容易配制且對色譜柱更友好的0.1%乙酸水。同時，為抑制水相中微生物的生長，在0.1%乙酸水中添加10%甲醇。為穩定流動相整體的pH值，在有機相中加入與水相相同體積的0.1%乙酸。

2.2 流動相的比例研究

本實驗分別研究梯度洗脫與等度洗脫對角黃素與葉黃素峰形的影響。采用等度（水相比例分別嘗試5%和10%）與梯度（水相比例為0～3 min，100% ～ 10%；3～ 10 min，10%；10～ 13 min，10%～100%）兩種方式分別進行洗脫，實驗結果表明，使用高比例有機相等度洗脫，化合物的峰形與梯度洗脫無差異，無其他雜質干擾，而等度洗脫化合物出峰時間早，分析時間更短，故本實驗流動相的比例為0.1%乙酸水（含10%甲醇）∶0.1%乙酸甲醇=5%∶95%。

2.3 進樣量的選擇

進樣量的大小影響化合物的最低檢測濃度，同時影響化合物的峰形（見圖3、圖4）。

圖3 角黃素在不同進樣體積下的色譜圖

本實驗對濃度為100 μg·L-1的角黃素與葉黃素標準溶液，分別進樣 1 μL、2 μL、5 μL、8 μL 和 10 μL，比較研究化合物色譜峰的峰形。結果表明，角黃素與葉黃素的色譜峰均隨著進樣體積的增大而變寬，特別是葉黃素進樣體積為8 μL時，其峰寬是進樣體積為5 μL時的2倍，如圖4。因此，綜合考慮化合物色譜峰峰形，選擇較高進樣體積以降低儀器對化合物的最低檢測濃度的影響，本實驗選擇進樣量為5 μL。

圖4 葉黃素在不同進樣體積下的色譜圖

2.4 基質效應研究

選取羅非魚、紅魚、金鯧魚等3種水產魚類的提取液作為空白基質，分別用純乙腈溶劑、空白基質原液、空白基質原液的10倍、20倍、50倍、100倍稀釋液，配制 10 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1、80 μg·L-1、100 μg·L-1的角黃素與葉黃素系列溶劑標準溶液和基質標準溶液，分別繪制溶劑標準曲線和基質標準曲線。通過分別比較不同水產魚類基質、同一水產魚類不同稀釋倍數基質的標準曲線斜率與溶劑標準曲線斜率的比值，分別研究不同水產魚類基質的基質效應差異和同一水產魚類不同稀釋倍數基質的基質效應變化規律，確定能夠消除基質效應的最優稀釋倍數。

基質效應（Matrix effect）計算公式為

式中：X為基質效應；bs為溶劑標準曲線斜率；bm為基質標準曲線斜率。

實驗結果如圖5和圖6所示，角黃素與葉黃素在3種水產魚類提取液基質原液中均表現出較強的基質抑制效應，2種化合物離子響應抑制率在-98%～-37%。隨著基質原液稀釋倍數的增加，基質抑制效應明顯減弱，在20倍稀釋倍數時減弱趨勢變小，漸趨平穩，基質效應基本保持在-25%～+20%。因此，為減少基質效應對檢測結果的影響，本實驗樣品提取液稀釋倍數為稀釋20倍。

圖5 角黃素在3種水產魚中的基質效應圖

圖6 葉黃素在3種水產魚中的基質效應圖

2.5 方法驗證

2.5.1 線性范圍、曲線方程、檢出限及定量限

用 100 mg·L-1標 準 儲 備 液 配 制 10 mg·L-1的 角黃素與葉黃素混合標準溶液，分別吸取0.010 mL、0.020 mL、0.050 mL、0.080 mL和0.100 mL混合標準溶液，用乙腈定容至10 mL，配成濃度為10 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1、80 μg·L-1和 100 μg·L-1標 準 系列，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線。用不同基質空白溶液配制濃度為10 μg·L-1的基質標準溶液，測定該濃度下信噪比（S/N），通過換算，計算S/N=3和S/N=10時對應的濃度，即為方法檢出限（LOD）和定量限（LOQ）[14]。實驗結果顯示，在濃度0～100 μg·L-1，角黃素與葉黃素的校正曲線相關系數r均≥0.996，線性良好。角黃素在3種水產魚基質的方法檢出限在0.03～0.09 mg·kg-1，定量限在0.09～0.30 mg·kg-1。葉黃素在3種水產魚基質的方法檢出限在0.07～0.10 mg·kg-1，定量限在0.22～0.51 mg·kg-1。線性范圍、曲線方程、檢出限及定量限詳見表3。

表3 角黃素和葉黃素線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限和定量限表

2.5.2 方法的準確度與精密度試驗

采用加標回收試驗，在空白羅非魚、紅魚、黃骨魚樣品中，加入角黃素與葉黃素混合標準溶液至2 mg·kg-1、10 mg·kg-1、20 mg·kg-1的 3 個水平，每個水平樣品重復處理測定6次，計算回收率與相對標準偏差（RSD），考察方法準確度與日內精密度。連續3天進行重復加標回收實驗，計算日間的相對標準偏差（RSD），考察方法日間精密度。由表4可知，方法的平均回收率為85.5%～117.7%，日內精密度為0.8%～6.2%，日間精密度為2.1%～11.3%。方法的準確度與精密度試驗結果均符合《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）[15]對回收率與精密度的要求，方法具有穩定可靠性。

表4 3種水產魚加標回收率和日內、日間精密度表（n=6）

2.6 實際樣品測定

采用本實驗對線下實體商超和線上購物平臺采購的黃骨魚、金昌魚、大小黃魚等21個水產魚類樣品中的角黃素與葉黃素進行測定。結果顯示，21個水產魚樣品中均未檢出角黃素。4個黃骨魚樣品中檢出葉黃素，含量在2.09～2.44 mg·kg-1。從檢測情況看，在水產養殖中違規使用角黃素的風險較低。

3 結論

本實驗建立高效液相色譜-串聯質譜法測定水產魚類中角黃素與葉黃素的含量。Thermo Fisher Accucore aQ色譜柱能夠對角黃素與葉黃素進行分離，以0.1%BHT-乙腈溶液為提取液，采用0.1%乙酸水溶液和0.1%乙酸甲醇溶液作為流動相，以1∶19的比例等度洗脫，在質譜（ESI+）正離子模式下以平行反應監測（PRM）模式檢測。在0～100 μg·L-1，角黃素、葉黃素的濃度與色譜峰面積分別呈良好線性關系，相關系數分別為0.996與0.997。方法的準確度與精密度試驗結果均符合《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）對回收率與精密度的要求，為水產魚類中角黃素與葉黃素的檢測提供了準確、穩定、可靠的檢測方法。