柑橘葉中柚皮苷成分分析

◎ 陳春艷，李 姣

（火箭軍工程大學，陜西 西安 710038）

柑橘是被子植物門、雙子葉植物綱、蕓香目植物，在溫暖濕潤氣候地方大量種植。柑橘中富含柚皮苷，這既是柑橘苦味的主要來源，同時也是柑橘中的藥用有效成分。本研究擬采用超高效液相色譜分析檢測漢中柑橘葉中的柚皮苷，得出柑橘葉中這種功能物質的含量，評價柑橘葉是否具有分離提純柚皮苷的開發利用價值，為柑橘的綜合利用提供基礎研究數據[1-3]。柚皮苷，又為柚苷（柚皮甙），是一種雙氫黃酮類化合物，通過查閱文獻可知柚皮苷類化合物主要集中分布在果皮、果汁和果核中，含量僅為1%～5%[4]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柑橘葉樣品（柑橘園現摘）洗凈，經烘箱60 ℃烘干、粉碎，過60目分樣篩，備用。

柚皮苷標準品（純度為98.7%），上海同田生物技術股份有限公司；甲醇（分析純），天津市登峰化學試劑廠；乙腈（色譜純），Burdick and Jackson公司；純水，杭州娃哈哈礦泉水。

1.2 儀器與設備

Waters ACQUITY-UPLC帶PDA檢測器，美國Waters公司；SHIMADZU AUY220萬分之一電子天平、SHIMADZU AUW220D十萬分之一電子天平，日本島津公司；KQ100-DA超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司；101-3A電熱恒溫鼓風干燥箱，滬南電爐烘箱廠；ZN-02中草藥粉碎機，北京興時利和科技發展有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 檢測波長的選擇

取適當濃度的柚皮苷標準品溶液，在Waters ACQUITY PDA檢測器下進行光譜掃描，選擇檢測波長。

1.3.2 樣品溶液制備

稱取柑橘葉1.00 g于100 mL的三角燒瓶中，加20 mL甲醇，超聲振蕩40 min，過濾溶液于50 mL容量瓶中，殘渣用10 mL甲醇再提取2次，合并提取液并用甲醇定容，用0.22 μm有機濾膜過濾后上機檢測。

1.3.3 標準品溶液的制備

精密稱取柚皮苷標準品2.6 mg，用甲醇溶解并定于10 mL的容量瓶，得到260 μg·mL-1的柚皮苷標準母液。分別取柚皮苷母液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL和1.0 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到濃度為 2.6 μg·mL-1、5.2 μg·mL-1、10.4 μg·mL-1、20.8 μg·mL-1和 26.0 μg·mL-1的標準品溶液。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×2.5 mm，1.7 μm）； 流 動 相：A為 乙腈，B為純水；采用梯度洗脫：0～1 min，10% A，1～5 min，40% A，5～6 min，10% A；檢測波長：288 nm；流速：0.3 mL·min-1，進樣量：5 μL，柱溫：30 ℃。

2 結果與分析

2.1 波長的確定

在Waters ACQUITY PDA檢測器下對柚皮苷進行光譜掃描，結果如圖1所示。為保證實驗的靈敏度和被測組分的準確性，經參考其他文獻，本實驗在288 nm波長處進行檢測[5]。

圖1 柚皮苷的紫外掃描圖

2.2 方法學考察

2.2.1 線性范圍考察

柚皮苷標準品溶液分別經0.22 μm微孔濾膜過濾后，按上述色譜條件依次進樣5 μL，測定其各自色譜峰面積，以色譜峰面積為縱坐標，進樣濃度為橫坐標，繪制標準工作曲線[14]。柚皮苷標準品色譜圖見圖2。標準曲線回歸方程為Y=155.113X-793.126，r=0.998 947，表明柚皮苷在2.6～26.0 μg·mL-1線性關系良好。

圖2 柚皮苷的標準色譜圖

2.2.2 精密度考察

取同一柑橘葉樣品，按上述方法制備樣品，在上述色譜條件下平行測定5次，每次進樣5 μL，測定橙皮苷的峰面積，計算相對標準偏差（RSD）考察方法的精密度。測得柚皮苷的峰面積分別為13 393.9、12 186.6、12 588.7、13 156.5和13 045.2，計算得到其相對標準偏差（RSD）為3.75%；RSD＜5.0%，表明在該條件下方法精密度良好。

2.2.3 穩定性考察

取同一柑橘葉試樣，在上述色譜條件下，分別于0.5 h、1.0 h、6.0 h、12.0 h和 24.0 h進樣 5 μL檢測柚皮苷的峰面積，計算相對標準偏差（RSD），以考察方法的穩定性。測得柚皮苷的峰面積分別為12 623.7、12 735.8、12 977.4、12 895.6和12 932.5，計算得其相對標準偏差（RSD）為1.16%；RSD＜3%，表明在該條件下方法穩定性良好。

2.2.4 重復性考察

取5個柑橘葉樣品，按上述方法制備樣品，在上述色譜條件下測定，每個樣進樣5 μL，測定橙皮苷的峰面積，計算相對標準偏差（RSD）考察方法的重復性。測得5個柑橘葉中柚皮苷的峰面積分別為12 286.5、12 347.8、12 154.7、12 433.2和12 154.1，計算得其相對標準偏差（RSD）為0.99%；RSD＜3%，表明在該條件下重復性良好。

2.2.5 回收率考察

精密稱取已測定柚皮苷含量為4.2 mg·kg-1的柑橘葉試樣1.0 g，加入260.0 μg·mL-1的標準品母液2 mL，按上述方法制備平行制備3個樣品，在上述色譜條件下進行檢測，計算該方法的回收率。柚皮苷回收率實驗結果見表1，該分析方法的平均回收率為99.35%，表明方法準確性良好；回收率的RSD為4.03%＜5%，表明該回收率實驗穩定性、重復性良好，該檢測結果可信。

表1 柚皮苷回收率實驗結果表

2.3 樣品溶液的測定

樣品溶液經0.22 μm微孔濾膜過濾后，上機檢測，色譜圖見圖3。由標準品色譜圖可知2.51 min峰為柚皮苷。

圖3 柑橘葉中柚皮苷分析色譜圖

3 結論

本文以柑橘葉為原料，采用超高效液相色譜對其中的柚皮苷進行定性、定量分析，為柑橘葉的綜合利用提供準確的信息。柑橘葉子全年不凋零，若其中柚皮苷含量高且穩定，就可全年批量生產提取，更好地研究利用柑橘葉中柚皮苷。