基于譜效關系的荊芥穗藥效部位治療結腸癌藥效質量標志物研究

賈夢楠，王 帥，2，李天嬌，2，包永睿，2，孟憲生，2*

(1.遼寧中醫藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600；2.遼寧省中藥多維分析專業技術創新中心，遼寧省現代中藥研究工程實驗室，遼寧 大連 116600)

荊芥穗為唇形科植物荊芥SchizonepetatenuisfoliaBriq.的干燥花穗，主產于江蘇、河北、浙江、江西等地。其性辛，微溫，歸肺、肝經，具有解表散風、透疹、消瘡的功效，炒炭可止血[1]。《本草圖經》[2]和《滇南本草》[3]均記載其可治便血，治婦人血風，止女子暴崩。現代藥理研究表明，荊芥穗具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒等作用[4-6]。近年來，學界主要圍繞荊芥穗藥效部位含量測定、質量控制等方面開展研究，但其治療結腸癌的藥效物質基礎尚未明確。因此，本研究開展荊芥穗藥效部位治療結腸癌的物質基礎研究，探討其活性部位與抗腫瘤藥效之間的關聯性，明確荊芥穗抗腫瘤的藥效質量標志物，為荊芥穗藥效部位的研發和質量控制提供參考。

本實驗采用HPLC法建立不同產地荊芥穗藥材化學輪廓譜，采用人腸癌HT-29細胞體外模型開展不同產地荊芥穗抗腸腫瘤藥理藥效研究；運用灰色關聯及偏最小二乘分析法，將化學輪廓譜與抗腫瘤活性進行關聯，篩選荊芥穗抗腸腫瘤的潛在藥效質量標志物，可用于荊芥穗的質量控制和評價，為荊芥穗的質量控制提供依據。

1 實驗材料

1.1 儀器

1260 II型超高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；SUNRISE酶標儀(瑞士TECAN公司)；US AUTOFLOW型CO2培養箱(德國NUAIRE公司)；AE31型倒置相差顯微鏡(Motic公司)；旋轉蒸發儀(美國SENCO公司)。

1.2 試劑與藥物

胎牛血清(美國GIBCO公司)；McCoy’s 5A培養基(美國GIBCO公司)；胰蛋白酶(美國GIBCO公司)；青霉素/鏈霉素溶液(Meilunbio公司)；CCK-8增強型溶液細胞活性檢測試劑盒(Meilunbio公司)。HPD-400大孔吸附樹脂(滄州寶恩化工有限公司)；原兒茶醛(批號：19031002)、咖啡酸(批號：17122804)、對香豆酸(批號：20102301)、木犀草苷(批號：21032701)、橙皮苷(批號：19071201)、異綠原酸C(批號：200912)、木犀草素(批號：17120702)、香葉木素(批號：181101)；10批荊芥穗飲片(購買信息見表1，由遼寧中醫藥大學中藥植物教研室許亮教授植物鑒定為唇形科植物荊芥SchizonepetatenuisfoliaBriq.的干燥花穗)。

表1 不同產地荊芥穗飲片的樣本信息

1.3 細胞株

人結腸癌細胞株HT-29(賽百慷生物技術股份有限公司)。

1.4 樣品制備

1.4.1 荊芥穗提取物制備 精密稱取不同產地荊芥穗藥材粉末(過4號篩)10.00 g，以15倍量的70%乙醇回流提取3次，放冷濾過，合并提取液，旋蒸濃縮至100 mL，采用HPD-400樹脂進行純化，收集洗脫液，45 ℃真空旋蒸至濃稠，70 ℃水浴蒸干即得荊芥穗藥效部位純化物。

1.4.2 供試品溶液制備 精密稱取荊芥穗藥效部位0.002 5 g，置于5 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，超聲(功率200 W，頻率40 kHz)1 min溶解，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

1.4.3 含藥培養液制備 精密稱定不同產地荊芥穗藥效部位，以含體積分數為10%的優質胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素雙抗溶液的McCoy’s 5A培養基為溶劑制成濃度為0.4 mg/mL的溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2 方法與結果

2.1 化學輪廓譜建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent poroshell 120 SB-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)；流動相：0.1%甲酸水(A)- 乙腈(B)；梯度洗脫程序：(0～5 min，15%→18%B；5～7 min，18%→18%B；7～9 min，18%→20%B；9～13 min，20%→20%B；13～25 min，20%→26%B；25～35 min，26%→36%B；35～40 min，36%→50%B)；40～43 min，50%→70%B；體積流量0.6 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量3 μL；檢測波長280 nm。

2.1.2 方法學考察 供試品各色譜峰相對保留時間，相對峰面積精密度、穩定性和重復性RSD均小于4%。

2.1.3 化學輪廓譜建立 精密吸取10批供試品溶液各3 μL，在“2.1.1”項色譜條件下進樣，化學輪廓譜見圖1。

圖1 不同產地樣品乙醇提取物化學輪廓譜

根據荊芥穗藥效部位的化學輪廓譜，從中篩選出22個主要色譜峰，得出其保留時間與峰面積，用于下一步譜效分析。經對照品指認，1號峰為原兒茶醛，2號峰為咖啡酸，4號峰為對香豆酸，6號峰為木犀草苷，8號峰為橙皮苷，9號峰為異綠原酸C，14號峰為木犀草素，19號峰為香葉木素。見圖2。

2.2 荊芥穗藥效部位對人腸癌HT-29抑制作用

采用AO/EB(吖啶橙/溴化乙錠)染色法計算荊芥穗藥效部位對人腸癌HT-29抑制率。取處于對數生長期、生長狀態良好的人腸癌HT-29細胞，以每孔1.5×104個接種于48孔板中，給藥干預后，每孔避光加入200 μL的AO/EB染液，在實時熒光顯微鏡下觀察，活力細胞為綠色熒光。通過ImageJ 2.1.0軟件對熒光細胞計數，可見相對空白組，各給藥組活力細胞數量均有不同程度的減少。見圖3。

圖2 混合對照品溶液及樣品溶液的HPLC

圖3 不同產地荊芥穗藥效部位對人腸癌HT-29細胞活力影響

荊芥穗藥效部位對人腸癌HT-29細胞的抑制作用以7 500 cell/孔的密度將HT-29細胞接種于96孔培養板，給藥干預后，避光加CCK-8溶液，于37 ℃恒溫培養箱中培養45 min后，用酶標儀在450 nm處掃描，測定吸光值(OD)，與空白組比較，各給藥組HT-29細胞吸光度明顯升降低(P<0.05)。

AO/EB染色法、CCK-8法權重系數為各50%，計算得到的荊芥穗藥效部位作用于人腸癌HT-29細胞的抑制率。見表2、圖4。

2.3 灰色關聯度分析

根據不同產地荊芥穗藥效部位化學成分輪廓譜，共提取出22個特征峰。將影響整體行為的數據進行分列，以反映系統藥效行為特征的數據序列(荊芥穗藥效部位作用于人腸癌HT-29細胞總抑制率)為參考數列，即母序列；以影響系統藥效行為的因素數據序列(不同產地荊芥穗藥材的不同峰面積經歸一化處理后)為比較數列，即子系列。采用灰色關聯度分析軟件(Grey ModeLing V 3.0)進行分析，得出不同產地藥材色譜峰與體外藥效學評價指標之間的關聯系數。見表3。

表2 不同產地乙醇提取物對人腸癌HT-29細胞的抑制率 (n=4)

圖4 荊芥穗藥效部位作用于人腸癌HT-29細胞總抑制率

由此可知，這22個主要色譜峰代表的化學成分對腸癌的抑制作用具有一定的差異性，其中相關系數大于0.85的色譜峰為1、2、4、5、6、8、9、14、16、17、19、21號峰。

表3 不同產地樣品乙醇提取物的色譜峰峰面積以及關聯系數

2.4 偏最小二乘回歸分析

由于灰色關聯分析方法僅標識成分對藥效的貢獻，而不表示其正相關或是負相關，因此，在灰色關聯分析方法基礎上進行偏最小二乘回歸分析方法可獲得正相關的藥效成分。本研究采用SIMCA 14.1統計軟件，以灰色關聯度分析中相關系數>0.85的14個主要色譜峰為自變量(X)，藥效數據為因變量(Y)，對0.4 mg/mL給藥濃度時的數據進行偏最小二乘回歸分析(PLSR)，所得擬合模型R2>0.9，Q2>0.8，說明潛在因子的信息綜合解釋能力較好，并具有良好的預測性，結果見圖5。經UVN標準化后，回歸方程為：Y=5.778 31+0.128 551X1+0.122 33X2+0.077 550 7X3-0.116 832X4+0.103 907X5+0.036 709 8X6+0.030 710 5X7+0.127 702X8-0.113 476X9-0.109 755X10+0.123 998X11-0.111 015X12。

其中，回歸系數的正、負代表各成分對抗腸腫瘤的正相關或負相關，可見1、2、4、6、8、9、14、19號共計8個色譜峰對藥效貢獻較大，起到正向促進作用。

圖5 0.4 mg/mL給藥濃度標準化回歸系數

3 討論與結論

由于HT-29細胞經荊芥穗藥效部位處理后，可能出現活細胞數不變，但代謝率降低，細胞呼吸減弱，使CCK-8法OD值稍有降低的現象。而AO/EB染色法可直接觀測活細胞數量。因此，本研究賦予AO/EB染色法與CCK-8法兩種方法權重系數各50%，得到不同產地荊芥穗藥效部位抗人結腸癌HT-29細胞的抑制率。

本研究采用HPLC法構建了10批荊芥穗樣品化學輪廓譜，獲得22個共有峰。采用灰色關聯分析獲得了荊芥穗抗腫瘤活性較強的12個色譜峰，采用偏最小二乘回歸方法對其進行譜效相關分析，獲得了荊芥穗抗腫瘤活性較強且正相關的8個色譜峰。由于灰色關聯分析方法僅標識成分對藥效的貢獻，而不表示其正相關或是負相關，因此，本研究在灰色關聯分析方法基礎上進行偏最小二乘回歸分析方法可獲得正相關的藥效成分。

本研究基于特征圖譜和藥效學研究，得到的8個成分與抗腸腫瘤作用密切相關。對香豆酸通過ros-線粒體途徑誘導結腸癌細胞凋亡[7]，木犀草素對結腸癌細胞增殖、遷移及上皮-間充質轉化有抑制作用[8]，橙皮苷能有效促進結腸癌細胞凋亡，從而抑制結腸癌細胞增殖，有效誘導結腸癌細胞自噬[9]，香葉木素可顯著降低結腸癌細胞在裸鼠體內的腫瘤生長速度[10]，木犀草苷可通過改善腸道微生物進而調理腸道健康[11]，原兒茶醛和異綠原酸C主要起抗炎作用[12-13]，咖啡酸具有良好的止血功效。因此，荊芥穗活性部位中的多種成分可能通過協同作用發揮抗炎、抗腸腫瘤作用，可初步推測其為荊芥穗的潛在的藥效質量標志物，可為荊芥穗的質量控制提供參考。