十一方藥酒的體外抑菌作用研究

劉舒凌，黃 娟，唐 杰，陳宏夏，張超裕，屈澤強(qiáng)*

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；2.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院，廣西 南寧 530007)

十一方藥酒由廣西骨科名老中醫(yī)梁錫恩所提供的驗(yàn)方制成，為廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院的傳統(tǒng)外用制劑。主要由乳香、沒藥、紅花、自然銅(煅)、續(xù)斷、龍血竭、三七等藥物組成，具有活血止痛、消腫散瘀的功效，用于治療跌打損傷、骨折筋傷和瘀血腫痛等疾患[1-2]。臨床實(shí)踐表明，十一方藥酒用于治療創(chuàng)傷性出血、創(chuàng)傷性化膿性感染及開放性骨折的傷口處理等取得了顯著效果[3]。以往的藥理研究發(fā)現(xiàn)：十一方藥酒對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性骨折、兔膝骨關(guān)節(jié)炎以及大鼠深Ⅱ度燙傷模型均具有治療作用[4-6]，但目前十一方藥酒抑菌作用的研究很少，是否具有抗菌作用尚不十分明確。因此，本研究選取5種受試菌對(duì)十一方藥酒的體外抑菌作用進(jìn)行研究，以期為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，為十一方藥酒的進(jìn)一步開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)菌株

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]、白色念珠菌(Moniliaalbican)[CMCC(F)98001]、乙型副傷寒沙門菌(Salmonellapara-typhiB)[CMCC(B)50094]、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]以及表皮葡萄球菌 (Staphylococcusepidermidis)[CMCC(B)26069]均由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基

瓊脂培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號(hào)：1103581)；水解酪蛋白脲(M-H)肉湯(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號(hào)：1103531)。

1.3 藥物和試劑

十一方藥酒(課題組自制[2]，其濃度為含生藥量193 mg/mL的藥液，批號(hào)：20200302)；白酒(酒精度：50°，南寧軍正食品廠)；生理鹽水(回音必集團(tuán)江西東亞制藥有限公司，批號(hào)：2020103113)；麥?zhǔn)媳葷峁?廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號(hào)：5109227)。

1.4 儀器

SW-CJ-1F型超凈臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；生化培養(yǎng)箱(韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司)；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)。

2 方法2.1 供試液的制備

分別取十一方藥酒和白酒，用0.22 μm針頭過濾器進(jìn)行過濾除菌[7]，備用。

2.2 抑菌活性的測定

抑菌活性測定分兩步進(jìn)行，第一步采用瓊脂稀釋法進(jìn)行濃度初篩，觀察不同濃度十一方藥酒對(duì)5種受試菌株的體外抑菌效果，測定最低抑菌濃度(MIC)；第二步采用試管二倍稀釋法測定十一方藥酒對(duì)5種受試菌株的最低殺菌濃度(MBC)。

2.2.1 瓊脂稀釋法抑菌實(shí)驗(yàn) (1)菌懸液的制備。取活化好的菌株，挑取一至多個(gè)菌落放入盛有適量生理鹽水的無菌試管中，先用生理鹽水稀釋至1號(hào)麥?zhǔn)媳葷峁?約為3×108CFU/mL)濃度，再用生理鹽水稀釋得到1×108CFU/mL菌懸液。

(2)含藥平板的制備[8]和分組。①十一方藥酒組：取過濾除菌后的十一方藥酒原液用生理鹽水進(jìn)行二倍法稀釋，配制成濃度為193 mg/mL、96.5 mg/mL、48.25 mg/mL、24.125 mg/mL、12.062 5 mg/mL、6.031 25 mg/mL的系列應(yīng)用液。吸取各濃度應(yīng)用液2mL加入已融化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基14mL，混合均勻后傾注于直徑90 mm的平板中，制成系列含十一方藥酒濃度分別為24.125 mg/mL、12.062 5 mg/mL、6.031 3 mg/mL、3.015 6 mg/mL、1.507 8 mg/mL、0.753 9 mg/mL的瓊脂平板，其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)分別為1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256，接種菌液。②陰性對(duì)照組：只加等量十一方藥酒原液和營養(yǎng)瓊脂，不接種菌液。③溶劑對(duì)照組：不加十一方藥酒，只加等量的營養(yǎng)瓊脂和溶劑白酒各系列應(yīng)用液(將白酒用生理鹽水二倍稀釋)，得到稀釋倍數(shù)分別為1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256的含白酒平板，接種菌液。

(3)菌液的接種。待上述瓊脂平板冷卻凝固后，將5種已配置好的菌懸液，吸取100 μL于瓊脂平板上均勻涂布，置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h后觀察。

(4)MIC的測定。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察各平板是否有菌生長。從無菌生長的平板中找出藥液濃度最低的平板，即該平板藥物濃度為十一方藥酒的MIC[9]。每種菌株平行實(shí)驗(yàn)3次。

2.2.2 試管二倍稀釋法抑菌實(shí)驗(yàn) (1)菌懸液的制備。取活化好的菌株，挑取一至多個(gè)菌落放入盛有適量M-H肉湯的無菌試管中，先稀釋至1號(hào)麥?zhǔn)媳葷峁?約為3×108CFU/mL)濃度，再用M-H肉湯稀釋得到1×106CFU/mL的菌懸液。

(2)MBC的測定[10]。取滅菌具塞試管12支，依次編號(hào)為1～12。每支試管中先加入1 mL的無菌M-H肉湯，隨后在1號(hào)試管中加入已除菌的十一方藥酒1 mL，用無菌滴管吹打混勻，用移液槍吸取1 mL加入2號(hào)試管中，混勻后再吸取出1 mL加入3號(hào)試管，依此類推至第9管時(shí)，混勻后吸出1 mL棄去。1～9號(hào)試管的藥液濃度分別為96.5 mg/mL、48.25 mg/mL、24.125 mg/mL、12.062 5 mg/mL、6.031 3 mg/mL、3.015 6 mg/mL、1.507 8 mg/mL、0.753 9 mg/mL、0.377 0 mg/mL。以上1～9號(hào)試管均加入細(xì)菌近似濃度為1×106CFU/mL的菌懸液100 μL，充分混勻。第10號(hào)試管加入1 mL藥酒，混勻后吸出1 mL棄去，不加菌液，作為陰性對(duì)照，以便觀察受試藥液是否受污染。第11號(hào)試管加入1 mL白酒，混勻后吸出1 mL棄去，再加菌懸液100 μL，作為溶劑對(duì)照。第12號(hào)試管加入1 mL生理鹽水，混勻后吸出1 mL棄去，再加菌懸液100 μL，作為陽性對(duì)照(細(xì)菌生長對(duì)照)。所有樣品放入37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h后觀察結(jié)果。由于十一方藥酒本身帶有顏色，并且由于劑型原因加入試管后各管均有一定混濁，為準(zhǔn)確判斷結(jié)果帶來一定難度。因此取每管液體50 μL轉(zhuǎn)種于瓊脂平板中，用無菌棉簽均勻涂布，37 ℃孵育18～24 h，以平板上未見細(xì)菌生長的試管所含最低藥物濃度為十一方藥酒的MBC。每種菌株平行實(shí)驗(yàn)3次。

3 結(jié)果

3.1 瓊脂稀釋法抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示，十一方藥酒對(duì)5種受試菌種有不同的最低抑菌濃度。十一方藥酒濃度≥6.031 3 mg/mL時(shí)，金黃色葡萄球菌平皿中無細(xì)菌生長；十一方藥酒濃度≥12.062 5 mg/mL時(shí)，銅綠假單胞菌、白色念珠菌、乙型副傷寒沙門菌、表皮葡萄球菌的平皿中無細(xì)菌生長，結(jié)果見表1和圖1。溶劑白酒在各稀釋倍數(shù)的平板中均有菌落，結(jié)果見表2和圖2。因此，十一方藥酒對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為6.031 3 mg/mL，對(duì)銅綠假單胞菌、白色念珠菌、乙型副傷寒沙門菌、表皮葡萄球菌的MIC為 12.062 5 mg/mL。

表1 瓊脂稀釋法測定十一方藥酒的抑菌效果

注：“-”表示沒有菌落；“+”表示有少量菌落；“++”表示有大量菌落。

3.2 試管二倍稀釋法抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示，在陰性對(duì)照中，試管澄清，表明培養(yǎng)基和藥液無細(xì)菌污染。溶劑對(duì)照(白酒+菌液)的試管混濁，轉(zhuǎn)種瓊脂平板后有細(xì)菌生長，提示溶劑白酒無明顯抑菌作用。十一方藥酒在濃度≥12.062 5 mg/mL時(shí)，5種受試菌的試管內(nèi)液體轉(zhuǎn)種瓊脂平板后均未見各細(xì)菌生長。因此，十一方藥酒對(duì)5種受試菌的MBC均為12.062 5 mg/mL。結(jié)果見表3、圖3、圖4。

表2 瓊脂稀釋法測定溶劑白酒的抑菌效果

注：“-”表示沒有菌落;“+”表示有少量菌落;“++”表示有大量菌落。

圖1 瓊脂稀釋法中不同濃度的十一方藥酒的抑菌效果

圖2 瓊脂稀釋法中不同稀釋倍數(shù)的溶劑白酒的抑菌效果

4 討論

感染是骨科臨床常見疾病及手術(shù)并發(fā)癥。骨科患者由于開放性損傷、手術(shù)切口及手術(shù)植入物等易感因素的存在，常并發(fā)感染[11]。在骨科患者感染細(xì)菌菌群的分布中，以金黃色葡萄球菌、G-腸球菌、銅綠假單孢菌、表皮葡萄球菌、白色念珠菌、大腸埃希菌等為主[11-13]。臨床研究表明，在全身支持療法的基礎(chǔ)上，以十一方酒濕敷治療未化膿感染型開放性骨折、十一方酒紗布和拔毒生肌膏交替外敷治療化膿感染型開放性骨折、術(shù)后用十一方酒淋濕傷面，患者的骨折愈合、創(chuàng)面愈合效果良好[3]。目前，十一方藥酒的抗菌、抗感染方面的實(shí)驗(yàn)研究很少，限制了其推廣應(yīng)用。因此有必要深入系統(tǒng)地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，為十一方藥酒的應(yīng)用和開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

表3 試管二倍稀釋法測定十一方藥酒的抑菌效果

注：“-”表示試管無細(xì)菌生長;“+”表示試管有細(xì)菌生長。

圖3 試管二倍稀釋法中十一方藥酒的MBC測定結(jié)果

圖4 試管二倍稀釋法中溶劑白酒的試管轉(zhuǎn)種平皿后的結(jié)果

中藥體外抑菌實(shí)驗(yàn)方法主要分為兩類：定性鑒別的抑菌環(huán)實(shí)驗(yàn)、定量測定的稀釋法實(shí)驗(yàn)[14]。其中抑菌環(huán)實(shí)驗(yàn)操作簡便，但不夠準(zhǔn)確，敏感性較低，一般用于藥物初期的活性篩選；而稀釋法雖操作較為復(fù)雜，但稀釋法沒有中間載體，直接在培養(yǎng)基中反應(yīng)，不存在吸收和揮發(fā)的問題，因而能比較準(zhǔn)確地反映樣品的抑菌效果，定量評(píng)價(jià)該藥的抑菌性能[14]。在稀釋法中，又分為瓊脂稀釋法和液體稀釋法。瓊脂稀釋法通常把中藥加入瓊脂中做梯度稀釋，觀察細(xì)菌在藥液瓊脂中生長和疏密情況；液體稀釋法通常在試管中進(jìn)行，采用肉眼觀察法(比濁法)來確定MIC。本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)采用抑菌環(huán)實(shí)驗(yàn)(紙片法)時(shí)發(fā)現(xiàn)十一方藥酒的抑菌圈很小，而采用稀釋法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)卻具有抑菌效果，推測原因可能為：其一，由于十一方藥酒原液的生藥濃度不高，無法達(dá)到紙片法的有效抑菌濃度；其二，十一方藥酒的抑菌物質(zhì)不容易由濾紙片擴(kuò)散進(jìn)入瓊脂。因此，本實(shí)驗(yàn)采用稀釋法進(jìn)行十一方藥酒的抑菌效果評(píng)價(jià)。

實(shí)驗(yàn)選擇了有代表性的實(shí)驗(yàn)微生物來評(píng)價(jià)十一方藥酒的抑菌活性。金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌是G+菌的代表菌種，是骨科創(chuàng)面感染的常見細(xì)菌[12]；銅綠假單胞菌是是一種抗性較強(qiáng)的G-細(xì)菌，是骨科開放骨折感染創(chuàng)面常見致病菌[12]；乙型副傷寒沙門菌是G-細(xì)菌，白色念珠菌為真菌。瓊脂稀釋法顯示：十一方藥酒對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為6.031 3 mg/mL，對(duì)銅綠假單胞菌、白色念珠菌、乙型副傷寒沙門菌、表皮葡萄球菌的MIC為 12.062 5 mg/mL。試管二倍稀釋法顯示：十一方藥酒對(duì)5種受試菌的MBC均為12.062 5 mg/mL。綜合兩種抑菌實(shí)驗(yàn)方法的結(jié)果，十一方藥酒在體外對(duì)5種供試菌均有抑菌活性。

由于十一方藥酒的溶劑為白酒，因此，實(shí)驗(yàn)中用白酒作為溶劑對(duì)照。白酒中含有乙醇，一般認(rèn)為，乙醇能溶解細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜中的類脂，破壞膜結(jié)構(gòu)并使蛋白質(zhì)變性，體積濃度70%時(shí)滅菌力最強(qiáng)，效果最好[15]。本實(shí)驗(yàn)顯示，白酒在瓊脂稀釋法中做1∶8倍稀釋，試管二倍稀釋法中做1∶2倍稀釋，5種受試菌均有菌生長，無法達(dá)到MIC，說明溶劑白酒的抑菌作用非常微弱，十一方藥酒的抑菌作用來源于藥物自身存在的抑菌成分。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和文獻(xiàn)[16]報(bào)道的結(jié)果有所不同，推測原因可能與不同實(shí)驗(yàn)選擇的溶劑對(duì)照不同以及十一方藥酒的制劑工藝不同有關(guān)。

綜上，十一方藥酒體外對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、乙型副傷寒沙門菌、表皮葡萄球菌有抑菌活性。本研究為十一方藥酒的功能活性提供了參考，也為其臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。十一方藥酒在疾病動(dòng)物模型中的抑菌作用，以及其抑菌的有效成分，還有待進(jìn)一步研究。