基于NIRS及HPLC的經典名方中苦杏仁炮制工藝研究

毛九州，李 帥，朱紅梅，張愛軍

(四川省中醫藥科學院，四川 成都 610041)

苦杏仁為薔薇科植物山杏(PrunusarmeniacaL.var.ansuMaxim.)、西伯利亞杏 (PrunusSibiricaL.)、東北杏(PrunusmandshuricaKoehne)、杏(PrunusarmeniacaL.)的干燥成熟種子[1]，有小毒。國家中醫藥管理局會同相關部門于2018年4月13日發布的《古代經典名方目錄(第一批)》[2]中第32首為小續命湯，目錄中給出了其原方描述、出處、組成、用法制法及劑型。早在1 400余年前，小續命湯首載于孫思邈的《備急千金要方》。在漫長的臨床實踐中，方劑中所述的藥材從基原、產地、藥用部位、加工還是炮制均出現了變化，因此筆者認為應盡可能地選擇與古方或者長期應用最為接近的藥物，過渡至現行標準或選擇與現行標準規定最為接近的藥物[3-4]。經文獻考證以及2020年版《中國藥典》的規定，建議本研究中苦杏仁按2020年版《中國藥典》的燀苦杏仁照燀法(通則 0213)去皮，用時搗碎[5]。

苦杏仁在中藥方劑中廣泛使用，主要用于治療咳嗽氣喘、胸滿痰多、腸燥便秘等，具有降氣止咳、平喘、潤腸通便的作用[6]。然而，苦杏仁有些許毒性，由于苦杏仁酶可以使苦杏仁苷轉變為野櫻苷，野櫻酶可繼續水解野櫻苷產生杏仁腈，最后，杏仁腈在酶的作用下可以產生苯甲醛和氫氰酸，從而導致中毒，甚至呼吸麻痹。經加熱炮制后的苦杏仁，苦杏仁酶被殺死進而降低苦杏仁的毒性，殺酶保苷的作用顯現出來[7]。并且，炮制苦杏仁可以在保留有效成分的前提下，除去非藥用部分。因此《中國藥典》2020 年版四部(通則 0213)炮制通則中規定燀法：取待炮制品投入沸水中，翻動片刻，撈出，放入冷水中，除去種皮，曬干[6]。但該法未明確寫明燀制加水量、燀制時間、干燥溫度和干燥時間等條件，本研究考察苦杏仁的炮制工藝參數，以期為燀苦杏仁的標準化生產提供參考依據。

近紅外光譜技術(NIRS)因具有實時快速、無損、成本較低、環境污染較小等特點，已在炮制過程中得到了廣泛應用。本研究將其應用NIRS技術快速對苦杏仁進行定性及定量測定，以期有利于苦杏仁炮制品的質量控制。

1 材料

1.1 儀器

液相色譜儀(安捷倫公司，美國，型號：1260型)；電子天平(梅特勒-托利多公司，瑞士，型號：XS205)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器，型號：KQ-300B)；電熱鼓風恒溫干燥箱(成都電烘箱廠，型號：DB-207)；藥典篩(浙江上虞市華豐五金儀器有限公司，型號：2號篩)；近紅外光譜儀(步琦公司，瑞士，型號：NIR Flex N-500)，石英玻璃樣品池、樣品旋轉器漫反射積分球、數據處理軟件(步琦公司，瑞士，型號：NIRcal 5.4)。

1.2 試藥

苦杏仁苷(110820-201808，HPLC 88.2%，中國食品藥品檢定研究院)。各批藥材均于當年3月份采摘，裝在塑封袋中，貯存于干燥密閉條件下，具體藥材信息見表1。炮制研究所用苦杏仁為(山杏PrunusarmeniacaL.var.ansuMaxim 購于山西省長治市平順縣)產地篩選KXR01，02，03，04，05，06共6批樣品均勻取樣，各取300 g，混合而成1 800 g。乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純；水用怡寶純凈水。近紅外掃描樣品為苦杏仁優質產地原藥材粉末01～15批(過2號篩)，優質產地燀苦杏仁粉末01～15批，產地篩選原藥材粉末01～18批，產地篩選不同炮制方法燀苦杏仁飲片粉末01～12批，具體信息如表1。

表1 藥材信息

2 方法與結果

2.1 干燥條件的選擇

2.1.1 不同干燥品的制備 根據2020年版《中國藥典》四部(通則 0213)炮制通則明確規定：燀法，水溫為沸水[5]。本次燀制工藝的考察以苦杏仁苷含量為指標，先進行適宜干燥條件的考察，包括干燥溫度和干燥時間兩個因素。確定干燥條件后，再進行加水量、燀制時間兩個因素對炮制品質量影響的考察。預試實驗進行了5倍、7倍、10倍水量的試驗，由于采用5倍水量燀制易煮干，未能達到合理的燀制時間，所以排除5倍水量，優選7倍、10倍水量因素。

本次試驗擬將苦杏仁600 g采用7倍水量燀制10 min，先均分后考察不同的干燥方法[8]。結合文獻[9]可知，選擇40 ℃用于干燥，消耗時間過長，100 ℃干燥溫度易使樣品表面出現焦斑，性狀不符合《中國藥典》要求，故考察的干燥條件由表2所示。

每份樣品至少50 g。由于苦杏仁含有杏仁油，每份樣品應整粒放入烘箱，不可敲碎或粉碎后進入烘箱，避免杏仁油揮發導致誤差。為使實驗數據準確，將所有干燥樣品分別用打粉機粉碎后再進行含量測定。

表2 考察干燥條件 (n=2)

2.1.2 炮制品的制備 生苦杏仁：取原藥材，除去雜質、殘留的核殼及褐色油粒；燀苦杏仁：取凈苦杏仁50 g，置下表所示水量的沸水中，加熱煮時間如表3所示，至苦杏仁膨脹，種皮易脫落時，撈出，置冷水稍浸，立即取出，搓去種皮，篩去種皮[10]。干燥方法采用“2.1.1”項下選出的方法。

表3 考察燀制條件 (n=3)

每份樣品至少50 g。采用“2.1.1”選出的干燥條件進行烘干，樣品粉碎稱量進行含量測定。

2.2 苦杏仁各干燥品、炮制品的苦杏仁苷含量比較

2.2.1 色譜條件 Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫30 ℃；體積流量1.0 mL/min；進樣量10 μL；紫外檢測波長207 nm；以乙腈-0.1%磷酸溶液(8∶92)為流動相等度洗脫。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取對照品，用甲醇溶解為44.17 μg/mL的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取各干燥條件的樣品粉末(過二號篩)約0.25 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱重，超聲(功率250 W，頻率50 kHz)30 min，冷卻后補重，搖勻，過濾，精密量取續濾液5 mL于50 mL量瓶中，加50%甲醇定容，搖勻，取續濾液過0.45 μm濾膜。

2.2.4 含量測定結果 供試品溶液10 μL注入HPLC，色譜如圖1所示，根據峰面積計算苦杏仁苷含量，含量以3次測得的平均值計，結果見表4、表5。根據結果確定燀制工藝后，將優質產地藥材統一按燀制工藝進行炮制后，測定其苦杏仁苷含量，結果見表6。

表4 干燥品含量測定結果 (n=2)

表5 炮制品含量測定結果 (n=3)

表6 原藥材及炮制品含量測定結果 (n=3)

2.3 苦杏仁炮制品的過氧化值比較

2.3.1 試驗條件 苦杏仁各炮制品的過氧化值根據2020年版《中國藥典》四部(通則2303)酸敗度測定法進行試驗。正己烷、三氯甲烷、冰醋酸等試劑均為分析純、新制碘化鉀飽和溶液、硫代硫酸鈉滴定液等按要求配制。

2.3.2 油脂提取 取樣品30 g(初粉)，置索氏提取器中，加正己烷120 mL后水浴加熱回流2 h，放冷，用3號垂熔玻璃漏斗濾過，濾液減壓回收溶劑至盡，殘留物為油脂。

2.3.3 過氧化值測定 取油脂2 g，精密稱定，置250 mL的干燥碘瓶中，加三氯甲烷-冰醋酸(1∶1)混合溶液30 mL溶解。精密加入新制碘化鉀飽和溶液1 mL密塞，輕輕振搖半分鐘，在暗處放置3 min，加水100 mL，用硫代硫酸鈉滴定液(0.01 mol/L)滴定至其呈淺黃色時，加淀粉指示液1 mL，繼續滴定至藍色消失；同時做空白試驗，照公式計算。

2.3.4 過氧化值結果 苦杏仁各炮制品的過氧化值結果如表7。

表7 炮制品過氧化值結果 (n=2)

2.4 燀制工藝小結

由表4結果可知，經過80 ℃、2 h干燥的樣品，其苦杏仁苷平均含量在樣品中最高，結合所需干燥時間和節約熱能的考慮，確定燀苦杏仁樣品的干燥條件為80 ℃下放置2 h。

預試驗曾通過單因素試驗對燀制水量進行初步篩選，5倍量水量較少，即使加熱時間為最短的5 min，仍有燒干的風險，后續試驗的水平為7倍水量及10倍水量。由表5結果可知，在同樣水量燀制的條件下，燀制10 min含量最高。所以燀制時間選用10 min，用水量需結合實際實驗以及節約水資源的考慮，7倍量水已足夠用于苦杏仁的燀制，7倍量水燀制10 min與10倍量水燀制10 min的含量相差0.11%，結合過氧化值的數據(表7)分析，7倍量水燀制10 min樣品的過氧化值最小，所以燀制方法選擇7倍量水燀制10 min。優質產地藥材同樣進行炮制，含量測定結果如表6。

臧彬如等[8]通過實驗，優選燀苦杏仁的工藝是加水量10倍，煮沸10 min，搓去皮，在電熱鼓風干燥箱60 ℃條件下，干燥6 h。種振等取凈苦杏仁，加入12倍的沸水中，燀制5 min，取出，置于冷水中浸制3 min，搓去種皮，置于70 ℃烘箱中，干燥，即可[11]。上述文獻研究所得工藝各不相同，本研究以燀苦杏仁的指標性成分苦杏仁苷含量、過氧化值等多指標代替單一指標來優選燀苦杏仁炮制工藝，所用水量較少，更適合工廠規模化生產。結合近紅外光譜技術，可在炮制過程中進行質量控制，一定程度上為燀苦杏仁的工業化生產提供參考。

2.5 近紅外研究

2.5.1 近紅外光譜的采集 取適量樣品粉末，置于平坦干凈的培養皿中，并使之均勻分布于皿底部。以儀器內置背景為參比，用NIR FLEX N-500型近紅外光譜儀進行掃描，采用積分球附件測量，分辨率8 cm-1；掃描范圍：4 000～10 000 cm-1，掃描次數8次，每個樣品重復裝樣掃描3次。光譜數據取 3 次采樣的平均值。

2.5.2 光譜直觀比較 優質產地苦杏仁原藥材粉末、產地篩選苦杏仁原藥材粉末、優質產地燀苦杏仁飲片粉末、產地篩選不同炮制方法燀苦杏仁飲片粉末共68批次的近紅外原始光譜見圖2，相同種類不同來源或批次的樣品，原始光譜基本一致。

2.5.3 光譜預處理及結果 為避免樣品中含有的無關因素干擾近紅外光譜，需對光譜進行預處理。NIRS法建模時常用的預處理方法有標準正則變換(SNV)、一階導數(db1)、標準化(ncl)、多元散射校正(mf)等[12]。

本實驗在NIRcal 5.4數據處理軟件中導入68批已采集好的198條光譜，按照6∶3的比例對樣品分為定標集(C-set)和驗證集(V-set)。采用 NIR Flex N-500 型近紅外光譜儀所帶的 NIRcal 5.4 數據處理軟件進行自動建模，系統自動對選中光譜進行標準化處理和微分計算，選取不同波段比例、不同波段范圍、不同前處理方法對原始的NIRS圖進行處理，旨在有效消除基線飄移，更全面地反映不同樣品之間的信息差異，根據綜合評價指標(Q值)選出最優模型，預處理結果見表8。

選用采用Clustar 方法進行建模，選擇將數據進行無量綱的轉化到0-1*后進行Between 0 and 1*，1st BCAP(n01，db1)的前處理方法對光譜進行前處理，由表8可知，最佳建模結果為選取5 000～10 000cm-1波段的圖譜，最終處理效果如圖3。

注：樣品編號1：DKXR01-15；編號2：KXR01-15；編號3：KXR01-15；編號4：DKXR01-06。

表8 預處理結果

2.5.4 定性模型的建立 按照83%的波段比例對，5 000～10 000cm-1的波段，通過NIR，采用聚類分析方法，可將DKXR與KXR進行區分。圖4中的橫坐標表示主成分l(PC1)的得分值，縱坐標表示主成分2(PC2)的得分值[12]，DKXR與KXR樣品明顯地聚類為互相獨立的2組。由圖4、圖5可知，此模型可以較好地將DKXR與KXR樣品分開，通過NIR可以將DKXR和KXR較好地進行區分。

圖3 預處理光譜

圖4 苦杏仁與燀苦杏仁的主成分二維得分圖

圖5 苦杏仁與燀苦杏仁的主成分三維圖

2.5.5 NIRS定性模型的驗證 對建立的模型進行驗證，以屬性距離和光譜殘差來表示模型驗證過程中光譜判別的依據[13]，DKXR所允許的最大距離為0.057 580；最大允許殘差為0.000 523；KXR所允許的最大距離為0.013 076，最大允許殘差0.000 523。在該模型中所有驗證集和校正集光譜均被正確判斷，準確率100%。

2.5.6 DKXR、KXR部分樣品建立定性模型 為苦杏仁和燀苦杏仁使用定性模型區分，將4類樣品，分為建模組和外部驗證組，如表9所示。原始光譜如圖6所示。

表9 分組情況

預處理方式同上文，采用 NIR Flex N-500 型近紅外光譜儀自帶的 NIRcal 5.4數據處理軟件進行自動建模，根據Q值判斷處理結果，Q值越大效果越好。

由表10可知，最佳建模結果為選取83%波段比例、5 000～7 144；7 404～10 000 cm-1波段的圖譜，采用n01，db1的前處理方法對光譜進行前處理，處理效果如圖7。

圖6 近紅外光譜疊加圖

按照79%的波段比例對5 000～7 144；7 404～10 000 cm-1的波段，通過NIR，采用聚類分析方法，可將DKXR與KXR進行區分。由圖8可知，此模型可以較好地將DKXR與KXR樣品分開，DKXR與KXR可以較好地分離。將54批樣品用于建模，按照6∶3的比例劃分樣品的定標集(C-SET)和驗證集(V-SET)，由結果可知KXR最大距離：0.000 030，最大允許殘差：0.005 049，DKXR最大距離：0.042 086，最大允許殘差：0.005 049。外部驗證結果為6批DKXR樣品均能準確驗證，準確率為100%。內部驗證結果為驗證和校正集均被準確判斷，準確率為100%。由實驗結果說明DKXR，KXR部分樣品也可建立定性模型，模型準確率較高。

表10 預處理結果

2.5.7 定量模型的建立 校正集和驗證集樣品的選擇是從采集光譜的68批樣品中，結合高效液相色譜法(HPLC)測定苦杏仁藥材及炮制品的苦杏仁苷含量作為其化學真值，建立起定量分析模型。選取45個有代表性的樣品組成校正集，剩余23個樣品為驗證集，驗證集樣品的含量在校正集含量范圍內，用于近紅外模型的建立。圖10為68批KXR及DKXR近紅外光譜疊加圖。

圖7 預處理光譜

圖8 苦杏仁與燀苦杏仁的主成分二維得分圖

預處理方式同上文，采用 NIR Flex N-500 型近紅外光譜儀自帶的 NIRcal 5.4 數據處理軟件進行自動建模，根據Q值判斷處理結果，如表11所示。

由表11可知，最佳建模結果為選取83%波段比例、5 000～10 000 cm-1波段的圖譜，采用SNV、db1的前處理方法對光譜進行前處理，處理效果如圖11。

圖9 苦杏仁與燀苦杏仁的主成分三維圖

圖10 68批KXR及DKXR近紅外光譜疊加圖

表11 預處理結果

由結果可知，校正集和驗證集相關系數(R2)分別為0.937 2 和0.922 2，校正集和驗證集公式分別為f(x)=0.937 2x+0.392 9，f(x)=1.030 7x-0.999 9，表明該方法簡便準確，快速可靠。模型具體參數見圖12。

3 討論

目前關于近紅外光譜技術在苦杏仁粉末的定性鑒別和定量測定的應用相關文獻報道較少，且僅有報道的文獻只研究了基于近紅外高光譜成像技術對不同產地苦杏仁和桃仁藥材的定性鑒別[14]及中藥液體制劑提取過程的近紅外定量測定苦杏仁苷[15]，采用近紅外光譜技術對苦杏仁炮制品進行測定相關方面，筆者未見國內外文獻報道。中藥材成分繁多，傳統評價方法是高效液相色譜法、氣相色譜法等，但這些常規分析方法耗時耗力，成本較高，屬于事后檢驗。近紅外光譜法測定法可初步應用于苦杏仁藥材及飲片質量的快速評價。

本研究仍存在一些不足之處，采用的樣本量不夠大，需采集更多產地的苦杏仁藥材及飲片光譜補充到定量模型中，提高定量模型的準確性和穩定性。

圖11 預處理光譜

圖12 苦杏仁中苦杏仁苷的測量值與預測值相關性

本研究通過文獻及實驗對經典名方中的燀苦杏仁炮制工藝及干燥條件進行了研究，基于NIRS、HPLC優選出了燀苦杏仁最佳炮制工藝，初步建立了對于苦杏仁炮制品的近紅外定性及定量模型，對保證燀苦杏仁飲片的質量具有一定的意義。