同屬不同種桑葉總黃酮的含量測定及分析

黃曉彤，史 銳，劉苗苗，叢龍嬌，劉斯文，王琪瑤

(遼寧中醫藥大學 藥學院，遼寧 沈陽 110000)

桑葉是桑科植物桑(MorusalbaL.)的葉子，我國約有11種桑葉，分布于全國大部分地區，以長江流域尤其江浙一帶為多[1]。桑葉具有降血脂[2]、抗氧化[3]、降血糖[4-5]、抗炎[6]等功效，在醫藥、保健品等領域的開發價值及利用價值較高[7]，近年來被廣泛用于生產代用茶[8]、焙烤制品[9]等產品中。桑葉中活性成分和營養物質極其豐富，例如萜類化合物[10]、黃酮[11]、多酚[12]等。黃酮類成分是桑葉藥材發揮藥效作用的最主要成分，現行《中國藥典》將蘆丁這一黃酮苷類成分作為桑葉藥材含量測定的指標性成分。桑葉在實際應用中存在品種混淆的問題，導致入藥品種不明確。通過查閱古代本草發現，古人對不同品種桑葉進行過研究且得出“雞桑最堪入藥”的結論，但目前中國藥典中僅收錄一種桑葉，且未明確品種，所以對桑屬不同種桑葉進行含量測定相關研究對桑葉資源的開發利用具有十分重要的意義。因此，本研究對同屬不同種桑葉中總黃酮含量進行測定，并采用SPSS 26.0軟件對其進行主成分分析，為桑葉藥材質量的評價提供實驗依據，對后續優化桑葉提取工藝具有深遠意義。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

藥材：桑葉分別采集于江蘇鎮江、新疆和田以及在中檢所購買的桑葉對照藥材，以上樣品由遼寧中醫藥大學康廷國教授鑒定為桑科桑屬桑樹的葉子，樣品序號、來源、采集時間等，詳見表1。

試劑：無水乙醇(沈陽市新化試劑廠)；HPD100大孔吸附樹脂(東鴻化工有限公司)；蒸餾水(娃哈哈集團有限公司)；氫氧化鈉(天津大茂試劑廠)；蘆丁標準品(成都格利普生物科技有限公司，批號：T27F10Z81699)；硝酸鋁(天津大茂試劑廠)；亞硝酸鈉(天津大茂試劑廠)。

表1 桑葉的樣品來源

1.2 儀器與設備

UV5100紫外可見-分光光度計(安徽皖儀科技股份有限公司)；FW100高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器設備有限公司)；中藥篩子(紹興市上虞英華貿易有限公司)；KQ5200DB型超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)。

2 方法

2.1 桑葉總黃酮含量測定方法

2.1.1 標準品溶液的制備 取5.18 mg蘆丁標準品，精密稱定，放置于25 mL容量瓶，用70%的乙醇溶液定容至刻度，充分搖勻，即得到0.207 2 mg/mL質量濃度的蘆丁標準溶液，將標準溶液于4 ℃冰箱中貯存備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 取桑葉粉末2 g，精密稱定，加30 mL石油醚(60～90 ℃)，加熱回流30 min，棄去石油醚液，藥渣揮干，向體系中加入30 mL乙醇，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加熱水10 mL，置60 ℃水浴上攪拌使溶解，濾過，濾液蒸干，殘渣加1 mL甲醇使其充分溶解，作為供試品溶液。

2.1.3 線性關系考察 取上述標準品溶液6份，每份分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，精密稱取后放置于25 mL容量瓶，向體系中加入1.0 mL 5%的NaNO2，充分混勻后放置6 min左右；精密量取1.0 mL的10%Al(NO3)3加入體系中，充分搖勻后靜置6 min；向體系中加入4%的NaOH 10.0 mL，加入70%的乙醇溶液適量，定容至刻度線，搖勻靜置15 min。得到濃度為1.66 μg/mL、3.32 μg/mL、4.97 μg/mL、6.64 μg/mL、8.30 μg/mL的標準品溶液。以70%的乙醇溶液作為空白對照溶液，測定其在510 nm處的吸光度值。以蘆丁標準品質量濃度(mg/mL)為X軸，Y軸為吸光度(A)繪制標準曲線，并求出線性回歸方程。

2.2 桑葉樣品總黃酮含量的測定

準確稱取桑葉13份，每份1.00 g，分別制備13份供試品溶液，向體系中加入1.0 mL5%的NaNO2，充分混勻，靜置6 min左右；加入1.0 mL的10%Al(NO3)3，充分搖勻，放置6 min；向體系中加入4%的NaOH 10.0 mL，加入70%的乙醇，并定容到刻度線，搖勻后放置15 min。同時空白對照溶液選擇70%的乙醇，進行基準校正后，用紫外可見分光光度計測定510 nm處的吸光度值。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度考察 精密稱取桑葉藥材(樣品3，魯桑)1.0 g，量取0.4 mL溶液，按“2.2”項下方法制備樣品，同時空白對照溶液選擇70%的乙醇，于510 nm波長處測定吸光度值A，平行測定6次，計算RSD值。

2.3.2 穩定性考察 精密稱取桑葉藥材(樣品3，魯桑)1.0 g，量取0.4 mL溶液，按“2.2”項下方法制備樣品，同時空白對照溶液選擇70%的乙醇，依次在 0、0.5、1、2、4、6、12、24 h 時，于510 nm波長處測定吸光度值A，計算RSD值。

2.3.3 重復性考察 精密稱取桑葉藥材(樣品3，魯桑)1.0 g，6份，量取0.4 mL溶液，按“2.2”項下方法制備樣品，同時以70% 的乙醇作為空白對照，于510 nm波長處分別測定6份樣品的吸光度值A，計算RSD值。

2.3.4 加樣回收率考察 量取已知含量的藥材粉末(樣品3，魯桑)1.0 g，精密稱定，按照 0.8∶1，1∶1，1∶1.5 比例加入蘆丁對照品，各平行測定3份，一共9份樣品，按“2.2”項下方法分別制備9份供試品溶液，同時以70% 的乙醇作為空白對照，于510 nm波長處分別測定6份樣品的吸光度值A，計算RSD值。

3 結果與分析

3.1 標準曲線的繪制

標準曲線如圖1所示，以蘆丁標準溶液的質量濃度(mg/mL)為X軸，吸光度(A)為Y軸，繪制標準曲線為y=0.076 1x+0.070 4(R2=0.999 3)。由結果可知其在1.66 μg/mL～8.30 μg/mL范圍內線性關系良好。

3.2 方法學考察結果

3.2.1 精密度考察 精密度考察結果見表2，6次吸光度的RSD值為1.19%，表明儀器精密度良好。

圖1 蘆丁標準曲線

表2 精密度測定結果

3.2.2 穩定性考察 穩定性考察結果見表3，0～24 h內測定的吸光度的RSD值為 1.12%，說明桑葉藥材總黃酮提取物在24 h內較穩定。

3.2.3 重復性考察 重復性考察見表4，6個樣品吸光度的RSD值為1.41%，說明該方法重復性較好。

表3 穩定性測定結果

表4 重復性測定結果

3.2.4 加樣回收率考察 加樣回收率考察結果見表5，按比例依次得到加樣回收率平均值為99.08%、99.28%、99.94%，RSD值分別為 0.43%、1.06%、0.30%，說明該方法準確度良好。

3.3 不同桑種桑葉中總黃酮含量測定結果

精密稱取13份桑葉粉末，每份1.00 g，制備供試品溶液，采用“2.1”項下方法測定不同種樣品總黃酮含量，不同種間總黃酮含量存在差異性，結果見圖2。

圖2 同屬不同種桑葉總黃酮含量比較

表5 加樣回收率考察結果

含量測定結果顯示，華桑中總黃酮含量最高為23.18 mg/g，其次是雞桑21.45 mg/g、山桑19.05 mg/g、蒙桑20.35 mg/g等。

3.4 桑屬不同桑種桑葉的綜合質量研究

本實驗以測量的總黃酮含量為原始數據應用SPSS 26.0軟件對其進行主成分分析，計算相關矩陣的特征值及其方差貢獻率(表6)，以特征值(VIP)>0.5 為提取標準，得到前兩個主成分的累計方差貢獻率為 84.776%(>80%)，同時碎石圖(圖3)也清晰呈現出各主成分所代表信息的走勢情況，說明前2個主成分反映了桑葉藥材中84.776%的信息量。

總黃酮成分得分系數矩陣顯示，成分1為0.243、成分2為0.920。為了綜合評價以黃酮為變量的桑葉藥材整體質量，根據成分得分矩陣對各主成分的載荷值進行計算，并根據其綜合得分的高低對不同種桑葉的質量進行排序，結果見表7，雞桑綜合排名第一。

表6 主成分信息和方差貢獻率

圖3 碎石圖

表7 綜合得分排名

4 討論

桑葉主要以輔助降壓及輔助降血脂為主要作用，桑葉黃酮可促進膽固醇含量的增加，從而改善高脂血癥大鼠模型SOD的活性，抑制丙二醛MDA的生成[13]。近年來相關研究得出，黃酮和多糖所具有的抗氧化、清除自由基作用，可修復或保持胰島素β細胞的生理功能，促進膜島素分泌，降低血糖。Hunyadi A等[14]發現異槲皮苷、蘆丁和綠原酸能有效降低2型糖尿病大鼠模型血糖。因此，黃酮中主要藥效成分含量的多少對臨床應用具有一定的影響，故選取總黃酮為指標成分進行統計學分析，本研究對同屬不同種桑葉進行了總黃酮含量的測定，為鑒別不同種桑葉提供方法學基礎，為確保臨床精準用藥提供實驗依據。

本實驗選擇總黃酮的測量結果為原始數據對其進行分析，提取出的主成分方差貢獻率為84.776%(>80%)，是造成種間差異的主要成分。因此根據得分系數對每個樣品的總得分進行計算，對不同種桑葉進行綜合排名。實驗結果顯示，雞桑綜合排名第一，與本草考證中“雞桑，最堪入用”的理論相互驗證。在此基礎上，有待進行藥理學研究對此理論進一步佐證。