藥用和茶飲絞股藍中總黃酮及多糖含量分析

盧澤雨，吳芳蕾，韋曉敏，溫秀萍*，于虹敏，林青青，楊成梓，林 羽，2

(1.福建中醫藥大學 藥學院，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學生物醫藥研發中心，福建 福州 350122)

絞股藍為葫蘆科絞股藍屬多年生攀援草本植物絞股藍Gynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino的全草，別名七葉膽、小苦藥、公羅鍋底等，生長于山坡林地、路旁灌叢中，主要分布于陜西南部和長江以南各地[1]。性寒,味苦，具有清熱解毒、止咳祛痰之功效。在 《救荒本草》一書中，絞股藍被廣泛用作蔬菜和食品[2]。明代醫藥學家李時珍在《本草綱目》中有關絞股藍的功效記載為“治瘡癤，蟲咬，涼血解毒，利小便”[3]。絞股藍中含有皂苷、黃酮、多糖、氨基酸以及無機元素等多種成分[4-8]。現代藥理研究表明，絞股藍具有多種藥理活性，如降血糖血脂、抗腫瘤、免疫調節、保護肝臟及心血管、抗氧化等[9-15]。因此，絞股藍也被全國各地茶葉加工企業成功制成絞股藍茶等保健品銷往市場，是一味藥茶兼用的常用中藥[16]。

目前關于絞股藍化學成分的研究多停留于其最主要有效成分皂苷上，而對藥用和茶飲絞股藍的總黃酮和多糖類成分研究較少。本文以藥用和茶飲絞股藍作為研究對象，優化絞股藍總黃酮的提取方法，測定不同產地絞股藍的總黃酮和多糖含量，把握絞股藍的市場現狀，以期為絞股藍的臨床安全有效用藥和質量評價提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

絞股藍樣品收集自各產地及藥材市場共14批次藥用絞股藍和17批次茶飲絞股藍(表1)，經福建中醫藥大學藥學院楊成梓教授鑒定為葫蘆科絞股藍屬植物絞股藍Gynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino。

1.2 試劑與儀器

試劑：D-無水葡萄糖(526H021，北京索萊寶科技有限公司)、蘆丁(B20771，上海源葉生物科技有限公司)；無水乙醇，亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉，蒽酮，濃硫酸，均為分析純，國藥集團化學制劑試劑有限公司生產。

儀器：UV-9000型紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)，XM7D-8222型電熱恒溫干燥箱(上海精宏實驗儀器廠有限公司)，KQ-500DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，SHB-III型循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)，DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海森信實驗儀器有限公司)。

表1 絞股藍樣品信息

1.3 實驗方法

1.3.1 波長選擇 精密吸取一定量的待測樣品溶液、蘆丁標準溶液，加蒸餾水至10 mL，再加1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置6 min，再滴加10%硝酸鋁溶液1 mL，輕輕振搖，靜置6 min，最后加入10 mL的4%氫氧化鈉溶液，并加蒸餾水至刻度，搖勻，靜置15 min，顯色后于紫外分光光度計在400～700 nm范圍內進行全波長掃描，掃描結果確定絞股藍中總黃酮最大吸收波長為510 nm。

精密吸取D-無水葡萄糖標準溶液30 mL，置于100 mL量瓶中定容，為標準品母液。再各取1 mL標準品母液于具塞試管中，冰水浴中分別加入4 mL蒽酮-硫酸溶液(4 ℃冷藏)，加完后置于沸水中煮沸10 min(自水重新沸起)，立即冷卻至室溫，顯色后于紫外分光光度計在400～700 nm范圍內進行全波長掃描，確定絞股藍中多糖最大吸收波長為620 nm。

1.3.2 標準曲線繪制 精密稱定蘆丁對照品0.100 g置于100 mL量瓶中，加60%乙醇置于水浴鍋中，加熱溶解，再加乙醇定容，搖勻，即得蘆丁對照品母液(蘆丁含量為1 mg/mL)。精密吸取蘆丁對照品母液各0.5 mL、1.5 mL、2.5 mL、3.5 mL、4.5 mL、5.5 mL于25 mL容量瓶中，加蒸餾水至10 mL，再加1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置6 min，再滴加10%硝酸鋁溶液1 mL，輕輕振搖，靜置6 min，最后加入10 mL的4%氫氧化鈉溶液，并加蒸餾水定容至刻度，搖勻，靜置15 min顯色，以只加顯色劑溶液作為空白對照，在510 nm波長處測定吸光度值A[17-18]。以蘆丁對照品濃度(mg/mL)為橫坐標X，吸光度A為縱坐標Y，繪制標準曲線，得到線性回歸方程Y=10.781X+0.047 1(R2=0.999 8)，由此可知其在0.02～0.22 mg/mL范圍內線性關系良好。

精密吸取10、20、30、40、50 mL D-無水葡萄糖對照品溶液，100 mL量瓶中定容。冰水浴中分別加入4 mL蒽酮-硫酸溶液(4 ℃冷藏)，加完后置于沸水中煮沸10 min(自水重新沸起)，立即冷卻至室溫，以相應空白試劑作為對照，在620 nm處測定吸光度值。以D-無水葡萄糖對照品濃度(mg/mL)為橫坐標X，吸光度A為縱坐標Y，繪制標準曲線，得到線性回歸方程Y=3.195X+0.112(R2=0.994 8)。該方程表明，當濃度在0.02～0.10 mg/mL時，其與吸光度線性關系良好。

1.3.3 總黃酮含量測定 樣品粉碎過三號篩，干燥，稱取5 g，置于錐形瓶中，加入65%乙醇65 mL，超聲90 min，抽濾，濾渣回收，提取4次。將濾液合并濃縮，定容于100 mL量瓶中，搖勻，得總黃酮供試品溶液。精密吸取2 mL總黃酮供試品溶液，放置于25 mL棕色容量瓶中，加蒸餾水至10 mL，按照“1.3.2”項下方法顯色。以相應空白試劑作為對照，在510 nm波長處測定吸光度值并根據標準曲線回歸方程計算其總黃酮含量[17-18]。

1.3.4 總多糖含量測定 稱定干燥后的絞股藍樣品粉末約1 g，包裝好后置于索氏提取器內，加入適量95%乙醇，多次虹吸至樣品提取液近乎透明，將藥渣小心取出并干燥，再采用水加熱回流提取2次，每次1 h。合并兩次濾液后，將濾液濃縮到100 mL，加入乙醇，使醇含量達到80%，存放于4 ℃冰箱中靜置12 h。過濾，用水溶解沉淀，溶液全部轉移至100 mL量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，即得多糖供試品溶液。精密吸取1 mL多糖供試品溶液，置于試管中，按照“1.3.2”項下多糖方法顯色。以相應空白試劑作為對照，在620 nm波長處測定吸光度值，根據標準曲線回歸方程計算其多糖含量[19-21]。

1.3.5 單因素試驗 分別設置不同乙醇體積分數、液料比、不同提取時間、不同提取次數，探究其對絞股藍總黃酮得率的影響。

1.3.6 正交試驗 以單因素實驗研究結果作為主要參考依據，選擇提取時間、乙醇體積分數、提取次數、料液比為考察研究對象，提取得到的總黃酮含量為考察指標，設計L9(34)正交實驗方案，稱取9份絞股藍干燥粉末，每份約5 g，進行提取分析。

1.3.7 總黃酮含量方法學考察 精密度考察。精密吸取“1號”供試品溶液2 mL，根據“1.3.3”項下方法操作測定吸光度，于同一環境下連續測定6次，測定A值，計算總黃酮提取量分別為1.410、1.441、1.433、1.423、1.443、1.435 mg/g，RSD為0.9%，說明實驗儀器精密度良好。

穩定性考察。精密稱取“1號”樣品提取液2 mL，根據“1.3.3”項下方法操作，于10、20、30、40、50、60 min分別測定吸光度，計算總黃酮提取量分別為1.443、1.440、1.435、1.431、1.421、1.410 mg/g，RSD值為0.9%，實驗顯色60 min內穩定性良好。

重現性考察。精密稱取“1號”樣品粉末6份，每份5 g，根據“1.3.3”項下方法進行操作，測定A值，計算總黃酮提取量分別為32.8842、31.934 1、31.824 8、32.451 2、32.211 5、32.058 7 mg/g，總黃酮平均提取量為32.227 4 mg/g，RSD值1.3%，說明實驗方法重復性較好。

加樣回收考察。精密稱取6份已知總黃酮含量的“1號”樣品0.2 g，均加入一定的蘆丁對照品。根據“1.3.3”項下方法并提取、顯色測定其吸光度值，按比例得到回收率為98.14%、101.04%、97.10%、97.50%、99.86%、99.68%，平均回收率為98.89%，RSD值為1.6%。說明該方法具有較好的準確性，可以作為絞股藍總黃酮含量的測定方法。

1.3.8 總多糖含量方法學考察 精密度考察。精密吸取同一份 D-無水葡萄糖對照品溶液，按照“1.3.3”項下方法操作，在同一條件下連續測定6次吸光度，分別為0.289、0.299、0.292、0.305、0.294、0.295，RSD為1.91%，表明該方法精密度良好。

穩定性考察。取絞股藍藥材樣品(1號)，按照“1.3.4”項下方法操作，于30、60、90、120、150 min分別測定吸光度，A值分別為0.385、0.396、0.377、0.390、0.387、0.381，RSD為1.73%，表明絞股藍多糖溶液在150 min內穩定性良好。

重現性考察。取同一批絞股藍藥材樣品(1號)6份，按照“1.3.4”項下方法操作，在同一條件下分別測定吸光度，A值分別為0.388、0.381、0.371、0.387、0.390、0.377，RSD為1.93%，表明該方法重復性良好。

加樣回收率考察。取已知含量的絞股藍藥材樣品(1號)6份，按照“1.3.4”項下方法操作，在同一條件下分別測定吸光度，計算回收率分別為98.95%、100.80%、99.44%、99.30%、99.05%、100.04%，平均回收率為99.60%，RSD為0.71%，表明該方法準確度良好。

1.4 數據分析

采用Microsoft Excel 2010和Graphpad Prism軟件對數據進行統計分析和制圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

用超聲波提取方法對總黃酮類化合物成分進行了提取，借助于乙醇能夠溶解黃酮類化合物的特性，故將提取溶劑確定為乙醇，在此基礎上，進一步選擇不同乙醇體積分數[40%、50%、60%、70%、80%、90%(乙醇-蒸餾水)]、不同料液比[1∶11、1∶12、1∶13、1∶14、1∶15(g/mL)]、不同提取時間(30、60、90、120、150 min)、不同提取次數(1、2、3、4次)4種影響因素對絞股藍總黃酮含量進行單因素考察。各因素分析結果表明，總黃酮含量分別在60%乙醇、提取時間90 min、提取次數3次、料液比1∶14(g/mL)時達到最大。

2.2 正交試驗選取最優提取方法

在單因數試驗結果基礎上進行4因素3水平L9(34)正交試驗，其中提取時間70、90、110 min，乙醇體積分數55%、60%、65%，提取次數2、3、4次，料液比1∶13、1∶14、1∶15(g/mL)，其余處理與“2.2.3”項下方法操作相同，提取顯色在510 nm測定A值。正交試驗結果得出最佳提取方法為提取時間90 min、65%乙醇體積分數、提取次數3次、料液比1∶13。最佳提取方法進行驗證實驗，平行測定3次，結果RSD值為1.25%，說明該方法真實，故確定用此最優提取方法對31批次絞股藍樣品的總黃酮含量進行測定。

2.3 不同產地絞股藍總黃酮含量分析

根據供試絞股藍總黃酮含量測定結果，不同產地31批次絞股藍樣品中，總黃酮含量均值為3.62%。絞股藍不同用途之間的總黃酮含量無顯著性差異(表2)。陜西的樣品無論是藥用還是茶飲絞股藍的總黃酮含量均高于其他產地的樣品；此外，廣西、吉林和云南的總黃酮含量較高，而安徽的含量較低，見圖1。14批次藥用絞股藍樣品中，總黃酮含量范圍為2.78%～4.17%，陜西、廣西和云南樣品的總黃酮含量較高，而四川、安徽和福建樣品的含量較低；17批次茶飲絞股藍樣品中，總黃酮含量范圍為2.51%～5.01%，總黃酮含量均值大于4.0%，從高到低分別來源于陜西、廣西、吉林和云南，且安徽樣品的總黃酮含量均值最低，為2.76%。

表2 藥用和茶飲絞股藍總黃酮、多糖含量比較

圖1 不同產地絞股藍的總黃酮含量

2.4 不同產地絞股藍多糖含量分析

根據供試絞股藍多糖含量測定結果，不同產地31批次絞股藍樣品中，多糖含量均值為3.43%。絞股藍不同用途之間的多糖含量無顯著性差異(表4)。陜西的樣品無論是藥用還是茶飲絞股藍的多糖含量均高于其他產地的樣品；湖南、安徽、云南和吉林樣品中多糖含量較高，而廣西、江西的含量較低，見圖2。14批次藥用絞股藍樣品中，多糖含量范圍在2.78%～4.19%，陜西樣品的多糖含量均值最高、為4.09%，湖南、安徽、云南和河北樣品的多糖含量較高，而廣西、福建、河南和四川樣品的含量較低；17批次茶飲絞股藍樣品中，多糖含量范圍在2.97%～4.27%，均值從高到低分別來源于陜西、河南、安徽、云南和吉林,其樣品的多糖含量均值較高，而福建、甘肅、廣西和江西樣品的多糖含量均值較低。

圖2 不同產地絞股藍的多糖含量

3 討論

3.1 絞股藍總黃酮和多糖含量分析

31批樣品的總黃酮含量在2.51%～5.01%之間，多糖含量在2.78%～4.27%之間。不同產地之間的含量差異可能與產地之間的環境氣候不同有關，無論是茶飲還是藥用，安徽產地的絞股藍總黃酮含量均較低，而陜西、云南和廣西的含量均較高；多糖含量方面，陜西的含量較高，而廣西的含量較低。故從總黃酮和多糖的含量來看，陜西產地的質量略好于其他產地，安徽次之。

藥用絞股藍總黃酮含量平均為3.52%，茶飲平均為3.71%，可見茶飲絞股藍的總黃酮含量略高于藥用品；藥用絞股藍多糖平均含量3.41%，茶飲為3.45%，茶飲略高于藥用。但對茶用、藥用絞股藍總黃酮含量和多糖含量分別進行方差分析(表2)，藥用和茶飲絞股藍樣品中總黃酮、多糖含量差異均不顯著(P>0.05)。故茶飲和藥用絞股藍之間品質無明顯差別。

3.2 總黃酮提取工藝優化

黃酮和多糖均屬于絞股藍中的有效成分。黃酮類化合物易溶于甲醇、乙醇等有機溶劑，查閱文獻可知常見提取試劑即為甲醇、乙醇，而水提法易混入大量雜質，導致檢測結果不準確[17，22]，因此本實驗采用乙醇作為提取溶劑。總黃酮提取方法較多，通過預實驗比較了回流法、索氏提取法、超聲提取法等，結果表明3種方法提取效率均較高，但考慮到超聲提取法操作簡便、耗時相對較短、提取效率高、提取溫度低等優點，采用超聲提取絞股藍中總黃酮[23]。

優化的絞股藍總黃酮的最佳提取工藝為提取時間90 min、乙醇體積分數65%、提取次數4次、料液比1∶13。該方法操作簡便、提取完全，工藝可行可靠，適用于絞股藍中總黃酮含量測定。本次實驗測定了31批絞股藍的總黃酮和多糖含量，發現不同用途絞股藍的總黃酮和多糖含量略有差異，但無統計學意義，說明藥用和茶用的絞股藍品質相當。不同產地絞股藍的總黃酮和多糖含量有一定差異，陜西產絞股藍的總黃酮和多糖含量略高于其他產地，分析可能與藥材種植及加工處理方式、產地自然條件等因素有關。后續可對其進行深入研究，為制定藥用和茶飲絞股藍的質量標準提供參考。