子癇前期患者血清和尿液中差異蛋白分析

劉麗欣，郭正光，孫偉，劉俊濤*

(1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院婦產科，國家婦產疾病臨床醫學研究中心，北京 100730；2.中國醫學科學院 北京協和醫院 基礎醫學院，北京 100730)

子癇前期(Preeclampsia，PE)是一種妊娠期特發的疾病，發病率為2%～8%，可導致流產、早產、胎兒生長受限、妊娠后婦女心血管病以及新生兒和產婦死亡等[1-2]。盡管在過去幾十年中進行了深入的研究，但PE的發病機制尚未完全闡明，因此缺乏特異性的檢測指標和方法來進行早期診斷或預測疾病的嚴重程度，目前分娩是唯一有效的治療方法。

早在PE臨床特征表現之前致病因素就已產生，因此及時診斷和適當治療，可以改善孕產婦和圍產期結局。然而，臨床中可靠的篩選試驗尚未廣泛開展，多普勒超聲測量的子宮動脈搏動指數(PI)、可溶性酪氨酸激酶1(sFlt-1)、胎盤生長因子(PlGF)、可溶性內皮素(sEng)、胎盤蛋白13(PP-13)、妊娠相關血漿蛋白 a(PAPP-a)和血管內皮生長因子(VEGF)，已被提議作為PE檢測的潛在生物標記物[3-5]。Zeisler等[5]指出，血清sFlt-1/PlGF比率可以在妊娠24～36周時預測未來幾周內是否會出現PE。然而，由于敏感性和特異性較低，這些標記物目前均未在臨床上用于早期產前篩查。因此，發現相關的生物標志物，對幫助準確預測、診斷和治療監測PE至關重要。

質譜技術擁有較高的靈敏度和準確率，已經逐漸成為蛋白質組學主要的研究方法[6]。蛋白質組定量技術按數據采集模式可分為數據依賴采集(DDA)和數據非依賴采集(DIA)兩種。DIA對所有窗口進行無偏向的數據采集，故DIA分析產生的定量結果比DDA具有更好的信噪比和重現性，可以為低豐度蛋白質提供準確的蛋白質定量信息，在臨床樣本的研究中擁有廣泛的研究前景[7-8]。本研究希望借助蛋白質組學方法找到PE與正常妊娠之間存在的差異蛋白，分析其作用的相關信號通路，為尋找鑒別PE的生物標志物研究奠定基礎，以期應用于PE的早期診斷、監測及處理，進而減少子癇、胎兒相關嚴重并發癥的發生。

材料與方法

一、研究對象

選取2019年9—12月就診北京協和醫院、符合PE診斷標準的孕婦為研究對象，選取同期正常妊娠孕婦為對照組。

PE診斷標準：妊娠 20周后血壓升高，收縮壓≥140 mmHg 和(或)舒張壓≥ 90 mmHg，伴有蛋白尿≥ 3.0 g/24 h，或隨機尿蛋白(+)或雖無蛋白尿，但出現以下標準之一者：血小板減少(血小板<100×109個/L)；肝功能受損(血清轉氨酶水平為正常濃度的2倍以上)；腎功能損害(血肌酐水平大于1.1 mg/dl或濃度升高至正常濃度的2倍以上)；肺水腫；新發生的中樞神經系統異常或視力障礙。排除妊娠合并免疫病、腎病、慢性高血壓等合并癥及并發癥。本研究通過北京協和醫院醫學倫理委員會批準(ZS-2748)，患者簽署知情同意書。

本研究共納入PE患者(P組)5例，對照組(C組)7例。

二、儀器與試劑

Orbitrap Fusion Lumos質譜儀(Thermo Fisher，美國)、NanoEasy 1200高效液相色譜儀(Thermo Fisher，美國)、免疫親和柱(Thermo Fisher，美國)、二硫蘇糖醇(Sigma，美國)、碘乙酰胺(Sigma，美國)、胰蛋白酶(Promega，美國)、BCA試劑盒(Thermo Fisher，美國)。

三、方法

1.血液、尿液樣本采集和儲存：采集孕婦剖宮產分娩前24 h、分娩后24 h外周血血清及尿液，尿液需排除感染及血液污染，-20℃冰箱短暫保存，-80℃冰箱長期保存。

2.樣本處理：血清樣本利用免疫親和層析柱去除高豐度蛋白；尿液經3 000 rpm，4℃，離心10 min去除細胞碎片沉渣，二硫蘇糖醇還原蛋白質，碘乙酰胺烷基化蛋白質，加入丙酮純化后離心，沉淀用Tris溶液(三羥甲基氨基甲烷)復溶，即為尿液蛋白。血、尿蛋白質利用胰蛋白酶酶解成肽段，收集酶解液，利用BCA試劑盒測定肽段濃度。

3.質譜鑒定：取15 μl樣本，與iRT肽段1 μl混合，用串聯質譜儀分離，利用在線電噴霧串聯質譜方法進行分析。共上樣4 μl樣品(分析柱：75 μm×25 cm，Acclaim PepMap C18)，以60 min的梯度分離樣品，柱流量控制在250 nl/min，柱溫為40℃，電噴霧電壓為2 kV。流動相A相為0.1% 甲酸水溶液；B相為含0.1% 甲酸的乙腈溶液。

肽段經由HPLC系統分離后，使用數據非依賴性采集模式進行質譜分析肽段混合物，質譜過程參數設置如下：(1)一級質譜MS：掃描范圍為350～1 200 m/z，分辨率為120 000，AGC target為300，最大注入時間為50 ms；(2)HCD-MS/MS：分辨率為30 000，AGC target為200，碰撞能量為25 eV、30 eV和35 eV，FAMIS電壓為45 V；(3)設置60個可變窗口進行采集，并同時設置重疊串口，每個窗口重疊設置為1 m/z。所有樣本隨機順序上機分析。所有樣本等量混合制備混合樣本作為質控樣本(即Mix組)。質控樣本在分析前、分析后和每10個樣本之間穿插上機分析，用以評估系統穩定性。

4.DIA數據分析：采用Spectronaut數據庫的默認參數，根據軟件自動選擇理想的窗口進行提取，iRT肽段軟件也可以自動矯正保留時間及質量窗口。Spectronaut自行校正后，符合條件的一級質譜離子都需要進行計算表達量，其他的干擾離子均需要去除(除非<3個碎片離子)。DIA二級分析對假陽性率<1%、排在前三的肽段進一步定量。篩選差異蛋白標準：Test分析P<0.05為差異蛋白。

5.生物信息學分析：對所有篩選出的差異蛋白進行生物通路分析(IPA)，將這些有差異表達的蛋白質的差異倍數及Swissprot編號錄入IPA，并對不同組差異蛋白的結果進行比較。根據相關通路中涉及的差異蛋白數目，采用left-tailed Fisher’s精確檢驗法進行計算相關通路的顯著性，并通過氣泡圖z評分和P值進行排序。

結 果

一、各組蛋白的定量分析和質量控制

血清中鑒定蛋白平均數分別為Mix組875個、P組839個、C組828個；尿液中鑒定蛋白平均數分別為Mix組1 644個、P組682個、C組1 378個。兩組測定蛋白經主成分分析及聚類分析，結果說明分析系統的穩定性、重復性良好(圖1～2)。

A：血清蛋白；B：尿液蛋白。

二、差異蛋白篩選

通過DIA方法進行血清、尿液差異蛋白鑒定，共篩選出血清中差異蛋白274個，其中P組84個，上調67個，C組190個，上調73個；尿液中差異蛋白671個，其中P組449個，上調224個，C組222個，上調105個。紅色為表達上調蛋白，藍色為表達下調蛋白，綠色為表達無差異蛋白(圖3～4)。

對差異蛋白進行組內及組間比較，具有重要功能的差異蛋白在P組和C組血清和尿液中變化趨勢相對一致。P組變化趨勢不一致的差異蛋白在產后血清中表達下調、尿液中表達上調，包括PRDX2、CD99、ITGB1三個蛋白；其中CD99、ITGB1與C組變化趨勢一致，即產后血清中下調，尿液中上調表達；而PRDX2與C組表達變化不同，即C組產后血清和尿液中均上調表達。

三、生物通路分析

1.心血管與高血壓相關通路：與C組相比較，P組產前、產后血液中差異蛋白在通路中變化不顯著，但尿液中差異蛋白在腎素-血管緊張素信號通路、擴張型心肌病信號通路、心臟-β-腎上腺素能信號通路、心肌肥厚信號通路、腎上腺髓質素信號通路中具有顯著激活作用(圖5)。

A：血清蛋白；B：尿液蛋白。

A：C組；B：P組。紅色：上調；藍色：下調；綠色：無差異。

A：C組；B：P組。紅色：上調；藍色：下調；綠色：無差異。

C1/C3：C組產前與產后相比；P1/P3：P組產前與產后相比。紅色表示激活，藍色表示抑制，氣泡越大，相關性越強。

2.細胞增殖與血管發生通路：與C組相比較，P組血液中VEGF水平下降；P組尿液中與血管發生相關的Ephrin受體信號通路、TGF-β信號通路激活，Ephrin B 通路受到抑制(圖6)。

3.內皮損傷相關通路：與C組相比較，P組尿液中差異蛋白在NRF2介導的氧化應激反應通路、HIF1信號通路和鐵死亡信號通路中具有激活作用(圖7)。

C1/C3：C組產前與產后相比；P1/P3：P組產前與產后相比。紅色表示激活，藍色表示抑制，氣泡越大，相關性越強。

4.細胞免疫相關通路：與C組相比較，P組血液中差異蛋白變化不明顯，但尿液中差異蛋白在嗜酸性粒細胞通路、中性粒細胞通路、樹突狀細胞(DC)通路中均不同程度的激活，差異蛋白在T細胞輔助1型(Th1)和Th2通路富集(圖8)。

C1/C3：C組產前與產后相比；P1/P3：P組產前與產后相比。紅色表示激活，藍色表示抑制，氣泡越大，相關性越強。

C1/C3：C組產前與產后相比；P1/P3：P組產前與產后相比。紅色表示激活，藍色表示抑制，氣泡越大，相關性越強。

與C組相比較，P組血液中差異蛋白變化不顯著，但P組尿液差異蛋白可以激活白細胞介素8(IL-8)、IL-2、IL-15、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)信號通路(圖9)。

與C組相比較，P組尿差異蛋白在B細胞通路激活，IL-4通路差異蛋白富集；C組尿液中補體途徑明顯抑制，相比之下P組血液中差異蛋白補體增加(圖10)。

C1/C3：C組產前與產后相比；P1/P3：P組產前與產后相比。紅色表示激活，藍色表示抑制，氣泡越大，相關性越強。

C1/C3：C組產前與產后相比；P1/P3：P組產前與產后相比。紅色表示激活，藍色表示抑制，氣泡越大，相關性越強。

討 論

PE是一種嚴重危害孕婦和嬰兒健康的疾病，引起PE的原因有很多且彼此之間存在一定關聯，因此單方面的原因和發病機制無法完整解釋PE的發生。為了更好地了解PE的發病原因，本研究利用質譜方法，檢測了PE患者血清和尿液中的差異蛋白，并通過生物信號通路分析，初步探索了與PE相關的通路變化。

差異蛋白IPA經典通路分析結果表明PE與心血管系統及高血壓通路調節密切相關。胎盤缺血可產生腎素和血管緊張素類物質導致血壓升高，心臟-β-腎上腺素信號增強與血壓升高正相關，心肌肥厚信號及Apelin內皮細胞信號通路參與了心血管調控與免疫，這些均與PE形成相關[9]。懷孕期間血流動力學改變，包括孕中期收縮壓、舒張壓和平均動脈壓降低，孕晚期略有升高[10]。懷孕期間心血管還會發生結構變化，這種適應性重塑導致母體心肌肥大，這種肥大是可逆的，使心臟能夠應對妊娠期增加的需求，與長期心血管功能障礙無關[10]，但有研究報道PE病人血管阻力增加，左心室壁增厚[11]，可能已形成不可逆的心肌肥大，PE病人在妊娠后的心血管疾病風險也較正常孕婦高，并且這種風險可以持續超過二十年[12]。

研究顯示VEGF水平下降，會影響滋養層細胞的分化和增殖，造成滋養層細胞侵入功能障礙，胎盤螺旋小動脈重塑受阻[13]。Ephrin B信號抑制，與血管發生異常相關[14]。與本研究血管發生通路顯示PE組血中VEGF水平下降、PE組尿液差異蛋白顯示Ephrin B信號通路抑制相符。報道稱TGF-β通路普遍低甲基化，且在PE病人胎盤中表達增加[15]，與本研究PE組TGF-β信號激活相符，該通路與滋養層入侵和遷移的控制有關。TGF-β在PE患者的血清中升高，并且可抑制許多組織中的VEGF[16]，這與本研究血漿中VEGF表達水平降低相符合。

鐵死亡是最近發現的一種程序性細胞死亡形式，近幾年來，不斷有學者指出鐵死亡在胎盤功能障礙和滋養層損傷中的潛在作用，且可能與PE發生發展具有一定的相關性，鐵過量及鐵死亡均會使胎盤血管侵襲受阻[17]，可加重脂質過氧化，造成內皮損傷。有研究報道PE患者血清鐵濃度、鐵蛋白和轉鐵蛋白飽和度顯著高于正常組，鐵穩態失衡與PE相關[18]。胎盤植入過程中通常會產生活性氧(ROS)[19]，由氧化應激水平上調引起ROS和脂質過氧化的積累通常與胎盤功能受損有關[20]。本研究中，PE組尿液中NRF2介導的氧化應激反應通路被激活，引起PE內皮損傷。

Boeldt等[21]認為中性粒細胞激活后粘附至血管內皮細胞，進一步導致炎癥級聯反應是PE內皮損傷的主要原因。內皮損傷是心血管疾病、炎癥發生發展過程的重要部分，炎癥又可觸發內皮細胞、淋巴細胞活化，活化的內皮細胞又會導致中性粒細胞轉運增加，進一步導致級聯反應[22]。活化的內皮通過IL-8促進中性粒細胞向胎盤遷移[23]，又可通過GM-CSF延長中性粒細胞的壽命[24]。PE女性子宮內膜中激活的單核細胞和巨噬細胞數量增加[25]，炎癥反應過度激活，均會導致子宮小動脈重鑄障礙，進一步影響胎盤著床。正常妊娠被認為是一種Th2型免疫狀態，有利于免疫耐受環境。PE患者則表現為Th1/Th2失衡，是以Th1為主的母體促炎狀態[26]。DC 細胞在正常妊娠期間保持失活或未成熟，然而在PE期間會受到不適當的刺激。高濃度GM-CSF與DC 中表達的長鏈非編碼 RNA(lnc-DC)一起誘導 DC 成熟[27-28]，成熟的DC 可以更有效地呈遞抗原，從而增加 Th1/Th17 細胞的增殖[28]，Th1/Th17 細胞會刺激促炎反應，從而顯著降低母體耐受性。本研究顯示PE患者的DC細胞通路、GM-CSF通路被激活，與之前的研究相符。

PE患者尿液中差異蛋白結果表現為B細胞通路激活、血液中差異蛋白在補體系統富集。免疫紊亂激活單核吞噬細胞系統來執行抗原提呈過程，促進淋巴細胞分化為漿細胞，然后產生過量抗體[29]。B細胞在PE中被不規則地激活，可產生血管緊張素Ⅱ-1型受體激動性自身抗體(AT1-AA)，這些抗體充當激動劑并誘導信號通路，導致血管收縮和醛固酮分泌，從而刺激腎素-血管緊張素系統并增加血壓[30]。

本次研究找到差異蛋白較多，可作為后續研究的基礎實驗。值得注意的是PE組產后血液中降低、尿液中升高的三個蛋白，分別是PRDX2、CD99、ITGB1，考慮可能是PE終止妊娠后病情好轉，因此相關蛋白在血液中快速下降，并通過尿液排出。然而CD99、ITGB1在PE組和正常組變化趨勢相同，PRDX2變化趨勢與正常組表達變化不同，但符合課題設想，因此需要待擴大樣本量進一步行靶向驗證質譜分析。

本研究是一項涉及大量循環蛋白質和相關病理生理通路的研究，這些蛋白質和通路可能為先兆子癇這一特定表型提供潛在的治療靶點。結合IPA通路分析，PE組差異蛋白參與了炎癥免疫反應過度激活、內皮損傷、血管發生異常等，激活腎素-血管緊張素、心肌肥厚等相關通路。尤其鐵死亡通路顯著被激活，考慮可能與PE發生發展相關。研究發現很多差異蛋白，這些蛋白有可能是PE相關病因，也有可能是PE疾病表現出的結果，這均需要我們進一步進行前瞻性研究，為后續篩選差異蛋白作為生物標記物奠定了基礎。