裂殖壺菌的雙碳源發酵生產二十二碳六烯酸控制策略

趙祥穎，張華秋，張家祥,,3，劉麗萍，韓墨，趙晨，姚明靜，劉建軍

1(齊魯工業大學(山東省科學院) 山東省食品發酵工業研究設計院，山東 濟南，250013)2(齊魯工業大學(山東省科學院) 生物工程學院，山東 濟南，250013)3(齊魯工業大學(山東省科學院) 食品科學與工程學院，山東 濟南，250013)

二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid， DHA)是一種食用安全的ω-3型多不飽和脂肪酸[1]，俗稱腦黃金，在促進人體視覺器官、大腦發育以及治療心臟疾病、炎癥、癌癥、焦慮癥[2-3]等方面具有獨特的生理功能，尤其對處于生長發育階段的嬰幼兒健康至關重要[4]。人體無法自行合成DHA，只能通過外部攝取。目前，DHA產品主要來源于深海魚油，但產品質量會隨魚種類、捕撈季節、地點的差異而不同，且易受環境污染。研究表明魚類體內的DHA是通過食物鏈蓄積獲得，主要來源于海洋微生物[5]。能夠合成DHA的海洋微生物主要是一些低等海洋真菌和微藻，如破囊壺菌(Thraustochytrium)、裂殖壺菌(Aurantiochytrium)和隱甲藻(Crypthecodinium)等[6]。微生物發酵法制備DHA，具有生長周期短、易于大規模培養[7]、不飽和脂肪酸成分單一、分離純化簡便等優點，有望替代魚油成為DHA主要來源。

裂殖壺菌是一種異養型海洋真菌，其脂肪酸組成簡單，DHA含量較高，是具有商業開發潛力的DHA主要生產菌株。裂殖壺菌可利用多種碳源生產DHA，葡萄糖因價格低廉，常被用作裂殖壺菌生產DHA的底物。在一些研究中裂殖壺菌利用甘油可以獲得更高的DHA產量[8-10]；也有研究表明，使用甘油和葡萄糖的混合碳源可以促進DHA的積累[11-12]，但甘油和葡萄糖2種碳源的混合策略比較復雜。在前期工作中，作者研究了1株裂殖壺菌突變株SFD-1502利用甘油和葡萄糖生產DHA的發酵行為，發現葡萄糖作為碳源有利于底物消耗；甘油作為碳源有利于DHA的積累。為了將兩種碳源優勢相結合，縮短發酵時間，提高DHA產量，進一步提高SFD-1502發酵生產DHA的效率，本文詳細探討了葡萄糖和甘油2種碳源單獨或混合培養對菌株SFD-1502的DHA油脂合成的影響，并構建一種新型的雙碳源發酵控制策略，即前期使用葡萄糖培養以利于菌體生長，中后期發酵液中的葡萄糖濃度為10～5 g/L時補加甘油以利于提高油脂中的DHA比例并減少菌體生長延滯期，實現了DHA的高效生產且具有較高的工業推廣價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

裂殖壺菌(Aurantiochytriumlimacinum)SFD-1502，實驗室保藏菌株。

1.1.2 培養基

人工海水(g/L)：NaCl 11.2，KCl 0.8，MgSO41.9，CaSO40.9，MgCl22.6。

種子培養基(g/L)：葡萄糖50，酵母粉20，谷氨酸鈉5，用50%(體積分數)人工海水配制。

葡萄糖發酵培養基(g/L)：葡萄糖132，酵母粉5.75，玉米漿14.6，谷氨酸鈉6.66，(NH4)2SO41，用50%(體積分數)人工海水配制。

甘油發酵培養基(g/L)：甘油120，酵母粉5.75，玉米漿14.6，谷氨酸鈉6.66，(NH4)2SO41，用50%(體積分數)人工海水配制。

1.1.3 主要試劑

葡萄糖，山東西王糖業有限公司；酵母粉，安琪酵母股份有限公司；十九烷酸標準品，Sigma-Aldrich公司；消泡劑，山師化工廠；其他試劑來自國藥集團。

1.1.4 儀器與設備

Alphaclean1300潔凈工作臺，力康精密儀器(上海)有限公司；恒溫搖床，上海知楚儀器有限公司；SBA-40D生物傳感分析儀，山東省科學院生物研究所；U3000液相色譜儀，戴安中國有限公司；7890B氣相色譜儀，安捷倫科技有限公司；7200分光光度計，尤尼柯上海儀器有限公司；LGJ-10E冷凍干燥機，北京四環科學儀器廠有限公司；5 L標準全自動發酵罐，匯森生物設備鎮江有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養條件

種子培養：將保存有菌株SFD-1502的甘油管接種于裝有50 mL種子培養基的500 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養22 h，按5%(體積分數，下同)接種量再次轉接到裝有50 mL種子培養基的500 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養17 h，用于接種搖瓶發酵。

搖瓶發酵培養：將培養好的液體種子，按5%接種量接種到裝有50 mL種子培養基的500 mL三角瓶中，28 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養。

發酵罐培養：接種量7%，28 ℃，通氣量0.5 m3/h，罐壓0.1 MPa，通過調節轉速控制0～12 h相對溶氧濃度為10%～20%，12 h以后相對溶氧濃度為0.5%～5%。

1.2.2 菌體濃度測定

發酵液經適當稀釋后在600 nm處測定吸光值。

1.2.3 細胞干重的測定

量取45 mL的發酵液于50 mL離心管中，4 000 r/min離心10 min，用1%(質量分數，下同)NaCl溶液離心洗滌2次，凍干稱重。

1.2.4 油脂含量的測定

稱取1 g干菌粉置于10 mL離心管中，用5 mL正己烷浸泡，并間接超聲波處理5 min，于3 000 r/min離心5 min，小心吸取上清液于干凈試管備用，重復抽提3次，將3次所得上清液合并后置于60 ℃烘箱，蒸干溶劑，待恒重后測定油脂含量(質量百分比)。

1.2.5 葡萄糖、甘油含量的測定

將發酵液離心(8 000 r/min，5 min)，后取上清液稀釋至50～200倍使用配備葡萄糖氧化酶電極的生物傳感分析儀測定殘余葡萄糖。

發酵液離心后取上清液，稀釋至合適濃度，用0.45 μm微孔濾膜過濾后，進行HPLC分析。HPLC條件：高效液相色譜儀，配備示差折光檢測器；色譜柱HPX-87H(Bio Rad, USA)；流動相0.005 mol/L H2SO4，三級水配制；流速0.6 mL/min；柱溫65 ℃；進樣量10 μL。

1.2.6 DHA含量的測定[13]

取發酵液5～10 mL，離心收集菌體，用1% NaCl溶液離心洗滌2次，棄去上清液，加入4 mL 4 mol/L鹽酸溶液，混勻后沸水浴10 min，冷卻至室溫后冰浴10 min，加入正己烷10 mL，充分振蕩1 min，靜置分層后，取上層清液1 mL，加入1 mL十九烷酸內標液(稱取十九烷酸標準品 0.04 g，于 10 mL容量瓶中，加入適量正己烷溶解，然后稀釋至刻度，搖勻備用)，和0.2 mL 4 mol/L KOH-甲醇溶液，劇烈振蕩1 min，離心分層，取上層有機相用于氣相色譜分析。

采用安捷倫7890B氣相色譜儀，DB-23(60 mm×0.25 mm×0.25 mm)毛細管柱用于油脂的氣相色譜分析。選用高純N2作為載氣，柱流量3.0 mL/min，尾吹流量30 mL/min，氣化室溫度250 ℃；檢測器為火焰離子化檢測器，溫度280 ℃，H2流速40 mL/min，空氣流速400 mL/min；柱箱初始溫度100 ℃，之后以25 ℃/min升至200 ℃，再以4 ℃/min升至230 ℃，保持9 min；進樣量為1 μL，分流比為30∶1。

采用內標法進行定量,脂肪酸含量按公式(1)計算：

(1)

式中：Ai,脂肪酸甲酯峰面積；As,內標峰面積；fis,脂肪酸甲酯i相對于內標的相對校正因子；Mi,脂肪酸i的相對分子質量；Mm,脂肪酸i甲酯的相對分子質量；m,待測試樣質量；ms,內標的質量。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖和甘油單一碳源培養菌株SFD-1502

分別以120 g/L葡萄糖和120 g/L甘油為碳源，采用搖瓶發酵進行菌株SFD-1502培養，不同培養時間取樣測定碳源消耗、細胞干重、細胞油脂含量以及油脂中DHA所占比例，繪制菌株SFD-1502的發酵進程曲線，如圖1所示。

a-底物質量濃度；b-細胞干重；c-油脂含量；d-油脂中DHA含量圖1 兩種碳源單獨發酵生產DHA進程Fig.1 Fermentation process of SFD-1502 by glucose and glycerol

單一碳源發酵結果顯示，以葡萄糖為碳源菌株SFD-1502底物消耗速度更快，培養84 h葡萄糖被全部消耗；以甘油為碳源培養菌株SFD-1502底物消耗速度慢，培養84 h甘油仍有約1/3殘留，培養至120 h，仍殘留4.76 g/L。以葡萄糖為碳源細胞生長速度也快，96 h達到最大值47 g/L，以甘油為碳源時108 h才達到最大值47.75 g/L，但2種碳源最終菌體干重差距并不顯著。以葡萄糖、甘油單一碳源培養，培養過程中細胞中油脂含量都是持續增加的，以葡萄糖為碳源油脂含量增長較快，以甘油作為碳源油脂積累滯后于葡萄糖，但總產量與葡萄糖相當。最令人關注的是以甘油為碳源油脂中的DHA含量顯著高于葡萄糖，油脂中DHA比例最高達47.49%，而以葡萄糖為碳源最高只有37.46%。

2.2 雙碳源混合發酵

通過上述結果發現以葡萄糖為碳源有利于菌體生長，發酵周期短，但油脂中DHA含量低，而以甘油為碳源油脂中DHA的含量高，但發酵周期長。為充分發揮2種碳源各自優勢，考察2種碳源預混合培養對菌株SFD-1502發酵產DHA的影響。將2種碳源按照不同的比例混合配制培養基，搖瓶發酵培養72 h取樣分析，結果如圖2所示。實驗設計72 h取樣是為了獲得2種底物的消耗情況，避免因培養時間過長底物被完全消耗造成的誤差。

采用葡萄糖、甘油雙碳源混合發酵，總碳源消耗量比葡萄糖單一碳源發酵顯著降低，甚至比甘油單一碳源還要低，同時菌體生長也受到一定程度的抑制。以葡萄糖單碳源發酵72 h葡萄糖消耗為93.7 g/L，菌體干重達到39.92 g/L，而雙碳源混合發酵總碳源消耗大約只有單獨使用葡萄糖的1/2。同時，采用雙碳源混合發酵時甘油被優先利用，葡萄糖的利用速率明顯降低。與甘油單一碳源發酵相比，葡萄糖同樣也影響了甘油的消耗速率(P<0.05)。在油脂合成方面，雙碳源發酵細胞中油脂含量明顯低于葡萄糖單一碳源，但油脂中的DHA比例似乎未受到影響，并隨著混合碳源中甘油比例的增加而增加。上述結果表明，使用葡萄糖和甘油的雙碳源混合發酵，會嚴重影響裂殖壺菌細胞生長和油脂合成。

a-碳源消耗量；b-細胞干重；c-油脂含量；d-DHA含量圖2 菌株SFD-1502葡萄糖+甘油混合碳源發酵結果Fig.2 Fermentation results of SFD-1502 using Glu and Gly mixed carbon source注:Glu-葡萄糖；Gly-甘油;同一圖中不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)

2.3 雙碳源分段控制發酵

2.3.1 雙碳源分段發酵甘油添加時機

葡萄糖有利于菌株生產，甘油有利于DHA的積累，但將葡萄糖和甘油簡單混合培養則嚴重阻礙了菌體生長和油脂合成。為了更好地發揮2種碳源的優勢，嘗試采用雙碳源分段發酵策略：前期以葡萄糖為碳源促進菌體生長，然后補加甘油促進DHA的合成。為了掌握甘油添加時機，首先考察了不同的初始葡萄糖濃度消耗進程(圖3)，20 g/L初始葡萄糖質量濃度大約需要24 h消耗完，40 g/L葡萄糖約需32 h，60 g/L葡萄糖約需44 h。

分別采用20、40、60 g/L質量濃度的葡萄糖進行前期菌體培養，當葡萄糖耗盡時分別補加甘油，使總碳源質量濃度均為120 g/L，發酵結果如表1所示。同樣培養120 h，葡萄糖耗盡時補加甘油的發酵液中甘油殘留量比甘油單一碳源時還要高，甘油添加量越多殘留量越高，這說明葡萄糖促菌體生長非但沒有加速甘油消耗，反而減緩了其消耗。

實驗又采用40 g/L的初始葡萄糖濃度對甘油添加時機進行了進一步考察。當葡萄糖質量濃度分別降至20、10、5、0 g/L時，補加80 g/L的甘油，發酵結果如圖4所示。當剩余葡萄糖質量濃度為20 g/L時補加甘油發酵結果和混合碳源相似，葡萄糖的存在抑制了甘油的消耗，延緩了整個發酵進程。當剩余葡萄糖質量濃度為10、5 g/L時補料，獲得了比較理想的效果：甘油消耗速有所提升，發酵120 h所有碳源均消耗完全，油脂中的DHA比例與甘油單一碳源結果接近，最高值達47.19%，因此，采用雙碳源發酵策略時，甘油的添加時機對發酵結果至關重要。

a-葡萄糖消耗；b-OD600圖3 SFD-1502利用不同濃度葡萄糖的發酵進程Fig.3 Consumption process of SFD-1502 using different concentrations of glucose

表1 菌株SFD-1502葡萄糖、甘油雙碳源分段發酵結果Table 1 Two carbon source staged fermentation results of SFD-1502

a-底物消耗；b-細胞干重；c-油脂含量；d-DHA含量圖4 甘油補加時機對菌株SFD-1502發酵DHA的影響Fig.4 Effect of glycerol addition timing on DHA production by strain SFD-1502

2.3.2 雙碳源分段發酵初始葡萄糖濃度

分別采用20、40、60 g/L初始葡萄糖質量濃度進行細胞前期培養，當發酵液中葡萄糖質量濃度降至10～5 g/L時分別補加100、80、60 g/L的甘油，發酵結果見表2。

表2 不同初始葡萄糖濃度對菌株SFD-1502雙碳源分段控制發酵的影響Table 2 Effect of different initial glucose concentrations on staged and controlled fermentation of strain SFD-1502 with two carbon sources.

初始葡萄糖質量濃度為20 g/L時，發酵液中的細胞干重以及DHA占總油脂的比例都顯著高于40、60 g/L的初始葡萄糖質量濃度，只有細胞油脂含量略低于40、60 g/L的初始葡萄糖質量濃度。同時，初始葡萄糖質量濃度為20 g/L時，補加甘油為100 g/L，培養120 h發酵液中已經檢測不到甘油，說明發酵周期也比單獨使用甘油短，充分發揮了雙碳源各自的優勢。

2.3.3 5L發酵罐雙碳源分段控制發酵

為了進一步充分顯現雙碳源分段控制發酵優勢，采用5 L發酵罐(裝液量3.5 L)對上述控制策略進行了放大實驗。葡萄糖、甘油單一碳源發酵結果如圖5所示。與搖瓶相比，5 L發酵罐發酵發酵周期明顯縮短了，細胞干重也略微提高，但細胞油脂含量和油脂中DHA含量都有所下降。

a-底物消耗和細胞干重；b-油脂含量和油脂中DHA含量圖5 菌株SFD-1502 葡萄糖、甘油5 L罐發酵進程Fig.5 Fermentation process of SFD-1502 in 5 L bioreactor with glucose and glycerol

葡萄糖、甘油雙碳源分段控制發酵結果如圖6所示，以20 g/L的葡萄糖為初始碳源，培養約8 h發酵液中葡萄糖質量濃度降至10～5 g/L，然后一次性補加100 g/L甘油，發酵進程幾乎沒有延滯期，甘油被快速消耗，55～60 h碳源被完全消耗，發酵周期僅為搖瓶培養的1/2，油脂中 DHA比例最高達45.50%，雖然比甘油單一碳源略低，但遠遠高于葡萄糖發酵。

圖6 菌株SFD-1502雙碳源分段控制5 L罐發酵進程Fig.6 Fermentation process of SFD-1502 in 5 L bioreactor with two carbon source added in segments

3 討論

工業發酵中最常用的碳源是葡萄糖，有時為了獲得更好的發酵結果，雙碳源、混合碳源也是不錯的選擇[14]。使用混合碳源發酵時如果工藝控制得當可顯著提高發酵效率，超出單一碳源發酵水平[15]。工藝控制策略因菌種、發酵產品和混合碳源而異。如白色鏈霉菌分批培養生產ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine，ε-PL)，采用葡萄糖-甘油混合碳源與葡萄糖單獨發酵相比發酵周期顯著縮短[16]，相應生物量和ε-PL的產率也有所提高。在木糖醇發酵過程中添加葡萄糖作為輔助碳源可以提高木糖轉化率[17]。通常，當2種碳源混合培養時微生物會表現出2種類型的生長行為：2種碳源依次被消耗(二次生長現象)或同時被消耗(共同利用)[18]，但2種碳源互相抑制的報道較少。本文研究了裂殖壺菌SFD-1502利用葡萄糖和甘油發酵生產DHA的行為，發現單獨使用葡萄糖作為碳源時，底物利用效率高，菌體生長快，但油脂中DHA含量低；單獨使用甘油作為碳源時，底物利用效率相對較低，菌體生長慢，但油脂中DHA含量高。為了促進菌體生長和增加細胞油脂中DHA的含量，實驗中采用葡萄糖和甘油混合發酵，結果發現葡萄糖和甘油同時存在時，2種碳源的利用速率都明顯降低，總碳源消耗速率遠低于單一碳源，說明2種碳源存在相互抑制。LI等[12]在研究A.limacinumSR21利用甘油和葡萄糖混合發酵生產DHA時發現當葡萄糖在25和50 g/L的時候補加甘油也會對底物消耗不利，這和我們的結果是一致的。轉錄組分析表明葡萄糖作為碳源可以激活糖酵解、磷酸戊糖2個代謝途徑，而甘油僅能激活甘油激酶途徑然后進入糖酵解途徑[19]，因此葡萄糖消耗速度更快些，更利于菌體的生長，甘油消耗速度慢，菌體生長滯后。但甘油為碳源時可能激活了聚酮合酶途徑[8]，該途徑則有利于DHA的積累。當葡萄糖和甘油同時存在時，裂殖壺菌會優先利用甘油，甘油在甘油激酶的催化下磷酸化為3-磷酸甘油，3-磷酸甘油會競爭性地抑制葡萄糖-6-磷酸異構酶的活性，從而阻止了磷酸丙糖向磷酸己糖的快速循環，使磷酸戊糖途徑和糖酵解途徑均受到抑制[20-21]，影響了葡萄糖的消耗；葡萄糖代謝中間產物1,6-二磷酸果糖也會抑制甘油激酶的活性，當葡萄糖代謝旺盛時胞內1,6-二磷酸果糖濃度增高，甘油激酶的活性受到抑制[22]，甘油消耗也會受到影響。以上可能是本文發現的葡萄糖和甘油同時存在時互相抑制的主要原因。葡萄糖和甘油分段發酵結果顯示當葡萄糖耗盡后再添加甘油，甘油的消耗速度也比單獨使用甘油有所降低，進一步對補加甘油時的葡萄糖濃度進行了考查，發現當葡萄糖質量濃度為5～10 g/L時補加甘油，沒有出現碳源消耗抑制現象，可以充分發揮了雙碳源各自優勢，獲得了非常理想的效果。LI等[11]都曾研究過葡萄糖、甘油雙碳源對異養微藻發酵生產DHA的影響，他們均設計了多種雙碳源添加方案，最后通過發酵篩選出最佳方案都比較復雜。他們都沒有對補加甘油時葡萄糖的濃度進行關注和深入探究。本文研究發現控制相對較低的葡萄糖質量濃度補加甘油可以獲得比較理想的結果，說明甘油補加時機至關重要，這個現象是我們首先發現并明示的，關于這種現象的生物學機制還需要進一步研究。

4 結論

筆者在前期研究中發現，裂殖壺菌SFD-1502以葡萄糖為碳源發酵生產DHA，油脂中的DHA含量遠低于以甘油為碳源發酵時，但甘油為碳源時底物發酵周期長。為了充分發揮2種碳源各自優勢，本文詳細研究了葡萄糖和甘油雙碳源發酵對SFD-1502生產 DHA的影響。首先探討了葡萄糖和甘油的雙碳源按比例混合發酵，發現甘油和葡萄糖同時發酵，2種碳源會相互抑制，生產效率比單一甘油碳源還要低；然后又嘗試先用葡萄糖促進菌體生長，當葡萄糖耗盡后再添加甘油，結果發現甘油消耗速度也低于單一甘油碳源。對甘油補加時機進行了研究，發現當發酵液中的葡萄糖質量濃度降為10～5 g/L時補加甘油可以獲得最佳效果。在5 L發酵罐中，初始葡萄糖質量濃度設為20 g/L，葡萄糖質量濃度降至10～5 g/L時補加100 g/L的甘油，發酵周期為55～60 h，油脂中 DHA含量45.0%左右。本文的雙碳源發酵控制策略簡單，效果明顯，適合工業化推廣應用。