高壓氧治療缺血性腦卒中患者外周血干細胞CD34+變化與臨床療效的研究*

黃 碩，吳佳慧，曾金明，李慧敏

上海中冶醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，上海 200941

缺血性腦卒中(IS)是一種急性腦損傷疾病，在世界范圍內(nèi)具有高病死率和致殘率，如何改善受損神經(jīng)功能、恢復(fù)患者運動功能、提高預(yù)后及生存質(zhì)量是目前關(guān)注的焦點[1]。高壓氧(HBO)目前已廣泛應(yīng)用于多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其通過改善腦血流量、啟動血管修復(fù)、誘導(dǎo)軸突白質(zhì)再生、恢復(fù)功能性血腦屏障、減少炎癥反應(yīng)和腦水腫等激活神經(jīng)可塑性，恢復(fù)大腦功能[2]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)干細胞移植可有效改善IS后神經(jīng)功能，具有良好應(yīng)用前景[3]，而起源于骨髓造血干/祖細胞代表性標志物的CD34+在中樞神經(jīng)修復(fù)中有重要作用。研究表明經(jīng)過HBO暴露后可提升患者外周血CD34+細胞數(shù)量，促進造血干細胞動員并修復(fù)受損腦功能[4]。本研究旨在通過觀察HBO對IS外周血CD34+細胞的影響，探討在HBO治療中造血干細胞動員過程及作用機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2021年1-12月于本院就診的IS患者60例為研究對象，均符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》[5]中的IS診斷標準，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會通過，患者或家屬自愿簽署知情同意書。納入標準：(1)經(jīng)頭顱CT或MRI確診腦梗死；(2)病程在2周至3個月；(3)年齡在40～85歲，性別不限。排除標準：(1)之前接受過HBO治療者；(2)有嚴重的內(nèi)科系統(tǒng)疾病、造血系統(tǒng)疾病、精神疾病患者；(3)經(jīng)檢查證實由腦腫瘤、腦外傷、腦寄生蟲病、代謝障礙等原因引起的腦梗死患者；(4)近期使用過抗菌藥物、糖皮質(zhì)激素、放療藥物、鎮(zhèn)靜安眠藥物、抗癲藥物等的患者；(5)不能配合治療者。

按照隨機數(shù)字表法分為對照組(30例)和治療組(30例)。兩組患者的年齡、性別、病程等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 兩組一般資料比較

1.2方法 所有患者均給予常規(guī)藥物治療，包括抗血小板聚集、改善循環(huán)、營養(yǎng)腦神經(jīng)等。康復(fù)治療在患者生命體征平穩(wěn)，神經(jīng)系統(tǒng)癥狀不再進展48 h后開始，包括：(1)肢位的擺放，體位轉(zhuǎn)換；(2)患肢主被動活動；(3)床上訓(xùn)練；(4)床邊坐位、平衡訓(xùn)練；(5)床椅轉(zhuǎn)換、站立訓(xùn)練；(6)步行、上下樓梯訓(xùn)練；(7)日常生活能力訓(xùn)練包括進食、修飾、穿衣、洗澡等；(8)作業(yè)治療，患肢無自主活動，利用健側(cè)帶動患側(cè)上肢進行推磨砂板、擦桌子、套圈等誘發(fā)肌肉活動，患肢有自主活動，采用運動再學(xué)習(xí)方法鍛煉上肢功能。以上訓(xùn)練每次90 min，每天2次，每周5 d，連續(xù)治療4周。

治療組在對照組基礎(chǔ)上，加用HBO治療，采用煙臺宏遠有限公司生產(chǎn)的GY3200型空氣加壓艙，治療壓力2.2 ATA，升壓時間15 min，待穩(wěn)壓后戴面罩吸純氧共3次，每次吸氧20 min，間隔休息5 min并吸艙內(nèi)壓縮空氣，最后經(jīng)勻速減壓15 min后常壓出艙，整個治療時間約105 min。HBO治療每天1次，每周5 d，10 d為1個療程，共2個療程。

1.3療效判定及觀察指標

1.3.1兩組患者臨床療效比較 以神經(jīng)功能缺損為判定標準，當(dāng)神經(jīng)功能缺損評分下降>80%為顯效；當(dāng)神經(jīng)功能缺損評分下降在20%～80%為有效，當(dāng)神經(jīng)功能缺損評分下降<20%為無效。總有效率=(顯效例數(shù)+有效例數(shù))/總例數(shù)×100%。

1.3.2簡式Fugl-Meyer運動功能評估量表(FMA)評分[6]用于評價四肢運動功能，滿分100分，分值越高表示運動功能越好。

1.3.3改良Barthel指數(shù)(MBI)評分[7]用以評估個人日常生活能力，滿分100分，得分越高代表個人日常生活能力越好。

上述2種評估量表分別于康復(fù)治療前、治療2周及4周后進行評定，并且同1例患者在治療前后由同1名評估師評定。

1.3.4外周血CD34+細胞數(shù)絕對值檢測 兩組患者均在治療前、治療2周及4周后分別于清晨采集空腹靜脈血2 mL，使用流式細胞儀(美國BD公司)嚴格按照 pro COUNT試劑盒標準，計算CD34+細胞數(shù)絕對值。

2 結(jié) 果

2.1兩組臨床療效比較 治療組的治療總有效率為80.00%，明顯高于對照組的53.33%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.80，P=0.028)。見表2。

表2 兩組臨床療效比較[n(%)]

2.2兩組治療前后FMA評分比較 治療前，兩組患者FMA評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療2周及4周后，兩組FMA評分均高于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與同期對照組比較，治療組FMA評分升高(P<0.05)。見表3。

表3 兩組治療前后FMA評分比較分)

2.3兩組治療前后MBI評分比較 治療前，兩組患者MBI評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療2周及4周后，兩組MBI評分均高于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與同期對照組比較，治療組FMA評分升高(P<0.05)。見表4。

表4 兩組治療前后MBI評分比較分)

2.4兩組外周血CD34+細胞數(shù)絕對值比較 治療前，兩組患者外周血CD34+細胞數(shù)絕對值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，治療2周及4周后，治療組CD34+細胞數(shù)絕對值高于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而對照組CD34+細胞數(shù)絕對值無明顯變化(P<0.05)；與同期對照組比較，治療組CD34+細胞數(shù)絕對值升高(P<0.05)。見表5。

表5 兩組治療前后外周血CD34+細胞數(shù)絕對值比較個/微升)

3 討 論

目前針對IS治療主要側(cè)重于缺血腦組織血管再灌注，盡早溶栓是最有效的治療手段，然而往往由于溶栓時間窗限制難以達到滿意效果，即使得到了救治，多達一半的IS存活患者出現(xiàn)了長期功能障礙，因此尋找改善神經(jīng)缺損的有效救治方法成為醫(yī)學(xué)界研究熱點。干細胞是擁有無限增殖及高度分化潛能的一類細胞，其特點是具有自我復(fù)制更新功能，近年來，干細胞治療在急性腦損傷修復(fù)中提供了一種新的策略，在IS治療中具有良好應(yīng)用前景[8]，在動物實驗(腦缺血大鼠模型)中研究發(fā)現(xiàn)，利用干細胞治療可削減病灶體積，增加膠質(zhì)細胞源神經(jīng)生長因子和血管內(nèi)皮生長因子分泌，改善血管及內(nèi)皮損傷，促進軸突再生，從而改善大鼠神經(jīng)功能[9]。目前針對干細胞應(yīng)用主要有兩種方案：一是外源性干細胞，是通過體外培養(yǎng)干細胞使之分化成所需細胞并進行移植，多采用腦內(nèi)、鞘內(nèi)、動脈、靜脈等方式給藥，主要有胚胎干細胞、間充質(zhì)干細胞、誘導(dǎo)多能干細胞[10]。二是內(nèi)源性干細胞,來自受體本身，包括神經(jīng)干細胞、造血干細胞，存在于人類和哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，主要分布于海馬、脈絡(luò)叢和室管膜下區(qū)，在缺血缺氧或外界誘導(dǎo)下可使得內(nèi)源性干細胞發(fā)生增殖、分化成神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞，并遷移到病灶區(qū)，修復(fù)和代償受損的神經(jīng)組織[11]，不同于外源性干細胞所帶來的法律道德、免疫排斥、分離不純等問題，內(nèi)源性干細胞因其來自受體本身，更適合臨床使用，具有廣闊的應(yīng)用前景。

造血干細胞作為內(nèi)源性干細胞，主要存在于骨髓、外周血、臍帶血中，在血液病、惡性腫瘤、下肢動脈硬化閉塞癥等疾病的治療中有廣泛的應(yīng)用。CD34+細胞作為造血干細胞特異性標志物，一方面可在早期造血干細胞中高表達，分化成各系血細胞，另一方面又可在非造血細胞中轉(zhuǎn)化，如分化成神經(jīng)細胞及內(nèi)皮細胞。研究表明造血干細胞可誘導(dǎo)IS患者神經(jīng)細胞的形成、促進新生血管及突觸生成、調(diào)節(jié)腦血流量和血腦屏障滲透率及激活內(nèi)源性修復(fù)[12]，參與神經(jīng)組織的修復(fù)，在神經(jīng)再生等方面發(fā)揮重要作用[13]。IS病理生理特點是腦組織缺血缺氧損傷導(dǎo)致機體一系列炎癥反應(yīng)[14]，而缺氧被認為是IS患者神經(jīng)元死亡的主要原因，因此增加腦組織氧合是治療腦缺血的有效手段。HBO治療通過物理方式提高氧分壓及血氧水平，擴大血氧彌散范圍，增加腦組織氧儲備及受損腦區(qū)灌注，促進半暗帶區(qū)氧供，改善線粒體功能和腦細胞代謝，減少細胞凋亡，增加神經(jīng)營養(yǎng)素和一氧化氮水平，促進內(nèi)源性神經(jīng)干細胞神經(jīng)修復(fù)[15]，此外還可修復(fù)受損內(nèi)皮功能，促進側(cè)支循環(huán)形成，建立新的軸突聯(lián)系，增加缺血腦組織供血，減少神經(jīng)細胞因缺血缺氧凋亡，從而使神經(jīng)功能得到恢復(fù)。THOM等[16]率先報道HBO能通過刺激一氧化氮合成，促進骨髓干/祖細胞釋放，使外周血CD34+細胞總數(shù)明顯增加。于強等[17]采用HBO治療腦外傷恢復(fù)期患者后發(fā)現(xiàn)，患者臨床癥狀明顯改善，外周血CD34+細胞數(shù)在治療后明顯上升，與治療前比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而白細胞計數(shù)無明顯變化。孫陽等[18]研究發(fā)現(xiàn)，HBO治療可使腦外傷患者昏迷程度及顱腦外傷情況減輕并改善預(yù)后，可能與HBO激活腦外傷患者骨髓干細胞動員，CD34+參與中樞神經(jīng)功能損傷修復(fù)有關(guān)。

目前，常用造血干細胞多取自骨髓，但供體難尋，臨床操作要求高等原因限制了其使用。因外周血取之便捷，越來越受到臨床青睞，然而在正常情況下，人體外周血干細胞CD34+水平極低，且保持相對穩(wěn)定，與年齡、性別無關(guān)[18]，如需利用，需提前注射造血干細胞生長因子來促進骨髓中干細胞釋放至外周血并進行提純，許多患者因其安全性、操作流程及治療周期過長等不愿接受也限制了其臨床使用。本研究發(fā)現(xiàn)，治療組臨床治療總有效率明顯高于對照組(P<0.05)；兩組患者治療后FMA評分和MBI評分均有明顯改善，且治療組改善程度更明顯(P<0.05)，表明HBO治療IS可有效緩解患者臨床癥狀，利于肢體功能恢復(fù)，提高患者日常生活能力；同時經(jīng)HBO治療后，治療組患者外周血CD34+細胞數(shù)絕對值逐漸升高，且高于同期對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩組患者在治療前CD34+細胞數(shù)絕對值并無明顯差異，經(jīng)過HBO治療后，治療組CD34+細胞數(shù)絕對值明顯高于對照組，同時神經(jīng)功能恢復(fù)情況也明顯優(yōu)于對照組，這表明HBO治療可動員患者骨髓干細胞釋放至外周血，從而提升外周血CD34+細胞數(shù)量，由此推測，IS患者體內(nèi)的外周血干細胞CD34+可能參與腦血管再生和腦組織修復(fù)。但本研究之所以采用外周血干細胞，一是外周血干細胞采集簡便，損傷小，二是CD34+細胞可作為造血干細胞特異標志物，臨床上可通過流式細胞儀進行CD34+計數(shù)。

綜上所述，HBO可通過動員骨髓干細胞釋放的途徑，提高IS患者體內(nèi)的CD34+細胞水平,參與神經(jīng)功能損傷修復(fù)。但本研究仍有不足之處，如樣本量偏少，治療時間較短，無法觀測CD34+細胞水平后續(xù)動態(tài)變化，以及CD34+細胞是否向損傷部位歸巢等，還需臨床進一步研究。