羅非魚骨發酵制備膠原蛋白肽工藝的響應面優化

◎ 韋倩妮

（北海職業學院，廣西 北海 536000）

我國羅非魚養殖量居世界前列，銷售和加工量大。在加工過程中，產生魚骨、魚片、魚鱗等大量下腳料，約占魚體的54%，其中魚頭、魚骨約占43%，占比最多[1]。我國水產品加工和副產物綜合利用的水平較低，若這些下腳料沒有得到有效利用，會造成資源浪費，甚至污染環境。隨著漁業的發展，魚類下腳料的高值化利用逐漸引起人們的重視，不少學者開展了研究。魚皮、魚頭、魚骨等部位常用于制備活化鈣，提取明膠、蛋白多肽和硫酸軟骨素等活性物質，也可制成即食魚排等各類休閑食品[2]。

制備蛋白肽常用酶解法和發酵法，通過微生物發酵法提取多肽，可充分發揮微生物胞外酶對蛋白質水解的作用，還可以利用其發酵過程產生的各種酶來分解脂肪和腥味物質[3]。枯草芽孢桿菌是一種傳統食品用菌，具有良好的產酶能力。本文以羅非魚骨、魚頭制備魚骨漿原料，用枯草芽孢桿菌發酵，制備膠原蛋白肽。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚，市售。枯草芽孢桿菌，北海職業學院食品檢驗檢測團隊選育；牛肉膏、蛋白胨，北京奧星生物技術有限公司；牛血清蛋白、福林酚酚試劑，北京索萊寶科技有限公司；酒石酸鉀鈉、無水硫酸銅、氫氧化鈉、碳酸鈉和磷酸氫二鉀，廣東省化學試劑工程技術研究開發中心；三氯乙酸，福晨天津化學試劑有限公司。培養基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，調節pH 值至7.4～7.5，用于種子液制備。

1.2 儀器與設備

HWS-12 恒溫水浴鍋，上海齊欣科學儀器有限公司；250B 振蕩培養箱，金壇市宏華儀器廠；UV1000紫外分光光度計，上海翱藝儀器有限公司；TD-4Z 離心機，四川蜀科儀器有限公司；YXQ-LS-50S Ⅱ高壓滅菌鍋、SW-CJ-2FD 超凈工作臺，上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 種子液的制備

將枯草芽孢桿菌活化，接種于種子液培養基中，置于37 ℃培養箱中，振蕩培養24 h。

1.3.2 魚骨膠原蛋白肽水解液的制備

羅非魚去鱗、去皮、去肉，清除內臟，將魚體清洗干凈，魚頭、魚骨下腳料絞碎，得到魚骨漿。分別稱取一定質量的魚骨漿和水于三角瓶中，用高壓滅菌鍋121 ℃滅菌20 min，得到發酵培養基。冷卻后，將枯草芽孢桿菌種子液接入發酵培養基中，置于一定溫度的培養箱，振蕩培養一定時間。將發酵液8 500 r·min-1離心10 min，收集上清，于98 ℃水浴5 min，滅酶，得到水解液。

1.3.3 單因素試驗

分別考察種子液接種量（3%、5%、7%、9%和11%）、發酵溫度（25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃和45 ℃）、魚骨漿添加量（8%、10%、12%、14%和16%）、發酵時間（18 h、24 h、30 h、36 h 和42 h）等4 個因素對水解度的影響。按照1.3.2 方法制備水解液，取上清，測定水解度。

1.3.4 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，選取接種量、發酵溫度、魚骨漿添加量3 個因素進行優化，因素和水平見表1。

表1 響應面實驗因素水平表

1.3.5 測定方法

魚骨漿總蛋白的測定采用凱氏定氮法（GB/T 5009.5—2016）。蛋白肽含量的測定采用福林-酚法測定，水解度采用TCA 法[4]。

幼兒園一日活動始于晨間鍛煉，幼兒園的孩子非常活潑好動，對各種體育活動都有著濃厚的興趣，若是晨間鍛煉的體育活動沒有充分調動幼兒的積極性，使其參與到晨間鍛煉當中，就會影響一日活動的整體效果。

式中：N0為魚骨漿總蛋白的含量，g/100 g；N1為水解前可溶性多肽的含量，g/100 g；N2為水解后可溶性多肽的含量，g/100 g。

2 結果與分析

2.1 接種量對水解度的影響

由圖1可知，接種量為7%時，水解度最大。當接種量較小時，菌量不足，發酵水平不高；隨著接種量增大，胞外酶分泌量增多，發酵周期短[3]，但接種量過多，代謝廢物亦隨之增多，不利于發酵，導致水解度低[5]。

圖1 不同接種量對水解度的影響圖

2.2 發酵溫度對水解度的影響

由圖2結果可知，溫度在35 ℃左右時，水解度最大。發酵溫度過高時，加劇了膠原蛋白肽鏈的斷裂，從而產生大量肽鏈片段[5]。

圖2 不同發酵溫度對水解度的影響圖

2.3 魚骨漿添加量對水解度的影響

由圖3結果可知，當魚骨漿添加量為12%時，水解度最大。當魚骨漿添加量少時，培養基所含水分較多，枯草芽孢桿菌所產生的胞外酶被稀釋，影響酶的作用效果，降低水解效果[3]。

圖3 魚骨漿添加量對水解度的影響圖

2.4 發酵時間對水解度的影響

由圖4結果可知，隨著發酵時間延長，水解度增大，當發酵30 h 以后，水解度變化不大；發酵時間過長，發酵液會有異味。

圖4 不同發酵時間對水解度的影響圖

2.5 響應面試驗優化工藝條件

2.5.1 回歸模型建立與方差分析

在確定單個因素適宜的范圍后，選取接種量（A）、發酵溫度（B）和魚骨漿添加量（C）為試驗因素，水解度（Y）為評價指標，用Design-Expert 11 進行Box-Benhken 試驗設計和數據分析，結果見表2，顯著性檢驗和方差分析結果見表3。通過回歸分析，得到回歸方程Y=27.77+1.07A+1.04B+1.09C-0.367 5AB-0.482 5AC+1.32BC+1.32A2-1.60B2-0.948 5C。

表2 羅非魚骨發酵制備膠原蛋白肽藝優化響應面試驗設計與結果表

表3 回歸模型方差分析表

由表3可知，此模型的P＜0.01，說明此模型極顯著。失擬項P=0.380 9，大于0.05，失擬項不顯著，說明該模型的擬合程度比較好，與實際情況較吻合。同時模型的復決定系數R2=0.973 1，變異系數CV=1.87%，說明該模型的預測結果有較高的精密度及可靠性。由P值可知，除二次項C2、相互項AB、AC對水解度無顯著影響外，其他項A、B、C、A2、B2、BC對水解度有顯著影響。根據F值大小，水解度受各因素影響的順序為C（魚骨漿添加量）>A（接種量）>B（發酵溫度）。

2.5.2 響應面圖形分析與最佳工藝確定

各個因素的交互作用響應曲面圖如圖5所示。由圖5可知，當接種量、發酵溫度、魚骨漿添加量取值較小時，效應曲面較陡，對水解度影響比較顯著。各交互作用中，接種量（A）與發酵溫度（B），接種量（A）與魚骨漿添加量（C）的等高線接近圓形，交互作用不顯著，發酵溫度（B）與魚骨漿添加量（C）的等高線為橢圓，交互作用顯著。通過軟件分析，得到水解的最佳工藝條件為接種量7.80%、發酵溫度36.59 ℃、魚骨漿添加量13.28%，在此條件下水解度的預測值為28.57%。為驗證響應面試驗預測結果的可靠性，并結合實際生產需要，將最優工藝參數調整為接種量7.8%、發酵溫度36.6 ℃、魚骨漿添加量13.3%，發酵時間30 h。按優化的條件進行3 次重復試驗，水解度的平均值為28.52%，與模型的預測值接近，說明本試驗優化的方法可行。

圖5 接種量、發酵溫度、魚骨漿添加量交互作用對水解度影響的響應面圖

3 結論

羅非魚加工中產生的魚骨、魚頭等下腳料占比較大，如果僅作用于生產傳統飼料，利用價值較低。本研究以魚骨漿為原料、水解度為評價指標，通過單因素試驗篩選，用響應面試驗優化水解的工藝條件，結果為接種量7.8%、發酵溫度36.6 ℃、魚骨漿添加量13.3%，發酵時間30 h。在此條件下，水解度可達28.52%。本試驗為水產品加工下腳料的高值化利用提供了參考，具有應用價值。