GSK3β、TLR-4在早期胃癌患者中的表達及與Hp感染的相關性探究

包華鑫 孫元鵬

早期胃癌主要是指胃癌浸潤深度在胃黏膜層或者是黏膜下層，研究結果顯示早期胃癌患者5年存活率達90%以上，目前我國早期胃癌患者發現率較低，大部分患者一旦發現已經處于晚期，雖然我國手術、放療、化療效果不斷提升，但是胃癌患者5年生存率只占40%[1-2]。臨床中關于胃癌發病機制尚不明確，公認幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）感染是導致胃癌發病的主要原因[3]。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）家族屬于一種模式識別受體，在機體免疫中發揮調節適應免疫作用，參與多種炎癥相關惡性腫瘤發生、發展過程，在細胞損傷、組織重構及修復過程中常常作為傳感器[4-5]。糖原合成酶激酶 -3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）作為一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶其具有多功能作用，參與糖代謝、細胞增殖、凋亡等過程，并且在多種腫瘤中顯示異常表達[6]。目前缺少GSK3β、TLR-4表達與胃癌Hp感染的相關研究。鑒于此，本研究回顧性分析海安市中醫院收治的94例早期胃癌患者臨床資料，探討GSK3β、TLR-4表達與早期胃癌患者Hp感染的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本文選取2018年11月-2020年11月在本院就診的早期胃癌患者94例，納入標準：患者均經過胃鏡、病理學檢查確診為胃癌；患者臨床分為Ⅰ、Ⅱ期；患者均符合文獻[7]中華醫學會消化內鏡學分會制定的中關于早期胃癌的診斷標準。排除標準：合并其他惡性腫瘤；進行放療、化療抗腫瘤治療；妊娠期、哺乳期患者；精神異常；合并其他感染性疾病；近1個月服用抗生素、質子泵抑制劑、鉍制劑等藥物。早期胃癌患者中，男60例，女34例，年齡 35～70 歲，BMI 21～26 kg/m2；其中 Hp 感染陽性40例為陽性胃癌組，Hp感染陰性54例為陰性胃癌組。選取同時期在本院健康體檢正常志愿者30例為對照組，男20例，女10例，年齡32～70歲，BMI 20～25 kg/m2。三組性別、年齡、BMI、胃癌家族史等臨床基線資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。陽性胃癌組與陰性胃癌組病灶直徑、病灶位置等基線資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），有可比性，見表2。本文研究患者及其家屬均知情，簽署知情同意書，研究經過本院倫理委員會批準。

表1 三組臨床基線資料比較

表2 陽性胃癌組與陰性胃癌組基線資料比較

表2（續）

1.2 方法

采用13C呼氣法檢測患者Hp感染：患者在檢查前1個月停止服用抗生素、質子泵抑制劑、鉍制劑等藥物，在患者空腹下進行，檢查前患者先在集氣袋中吹氣，之后口服13C膠囊，25 min后，患者向另一個集氣袋中吹氣，通過13C檢測呼吸儀觀察患者Hp感染結果。采集三組研究對象入院當天空腹肘部靜脈血 3 ml，2 000 r/min 離心處理 5 min，轉速為 2 000 r/min 離心干預 5 min，-20 ℃保持。采集到的血液標本，通過1 000 r/min離心處理后提取沉淀，滴加裂解液、反復凍融后，120 000 r/min離心處理，提取上清液，采用酶標儀檢測GSK3β、TLR-4蛋白濃度，保存。滴加10%的分離膠，封閉，吸干水分，給予5%的濃縮膠灌注，凝固后，將其在電泳槽中固定，加5μl Marker、變性蛋白樣品，電泳干預30 min，待蛋白分離膠底，結束電泳；轉膜成功后將硝酸纖維素膜（nitrocellulosefilter membrane，NC）膜在5%的脫脂奶粉中封閉固定1 h，加一抗（GSK3β、TLR-4 1∶1 000）孵育，經過震蕩洗膜后加二抗（GSK3β、TLR-4 1∶10 000），孵育，再次震蕩洗膜，使用紅外熒光成像系統對結果給予分析。以GAPDH為內參。

1.3 統計學處理

采用SPSS 25.0軟件進行數據處理。計量資料以（±s）表示，組間兩兩對比采用獨立樣本t檢驗，三組間比較采用方差齊性檢驗；以率（%）表示計數資料采用χ2檢驗。采用受試者工作特征（receiver operator characteristics，ROC）曲線分析GSK3β、TLR-4對早期胃癌患者Hp感染的預測價值；相關性采用Spearman分析；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GSK3β、TLR-4表達比較

與對照組相比，陽性胃癌組、陰性胃癌組GSK3β表達高，TLR-4表達低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與陰性胃癌組相比，陽性胃癌組GSK3β表達高，TLR-4表達低，差異有統計學意義（P＜0.05），見表 3。

表3 三組GSK3β、TLR-4表達比較（±s）

表3 三組GSK3β、TLR-4表達比較（±s）

*與對照組相比，P＜0.05；#與陰性胃癌組相比，P＜0.05。

組別 GSK3β TLR-4陽性胃癌組（n=40） 1.35±0.15*# 0.43±0.09*#陰性胃癌組（n=54） 1.02±0.10* 0.86±0.08*對照組（n=30） 0.45±0.05 1.16±0.25 F值 47.290 25.626 P值 0.001 0.001

2.2 GSK3β、TLR-4對早期胃癌患者Hp感染的預測價值

ROC曲線分析血清GSK3β、TLR-4預測早期胃癌患者Hp感染的曲線下面積（area under the curve，AUC） 分 別 為 0.745（95%CI：0.648，0.842，P=0.001）、0.721（95%CI：0.619，0.821，P=0.001），見表4、圖1。

表4 GSK3β、TLR-4診斷早期胃癌患者Hp感染的效能

圖1 GSK3β、TLR-4診斷早期胃癌患者Hp感染的ROC曲線

2.3 GSK3β、TLR-4表達與早期胃癌患者Hp感染的相關性

采用Spearman相關性分析，以1表示Hp感染為陰性，以2表示Hp感染為陽性。GSK3β表達與Hp感染呈正相關（r=0.483，P=0.001）；TLR-4表達與Hp感染呈負相關（r=-0.538，P=0.001）。

3 討論

大部分早期胃癌患者臨床表現不明顯，所以導致早期胃癌患者檢出率較低，在臨床中主要通過胃鏡直接觀察患者胃黏膜狀況，診斷胃癌的金標準是病理組織學檢測，但是其具有侵入性、價格高等缺點，部分患者依從性、耐受性較差，因此選擇操作簡單、無創、敏感性高的檢查手段對患者來說至關重要[8-9]。本研究通過ROC曲線，GSK3β、TLR-4表達均與早期胃癌患者Hp感染的獨立相關，提示GSK3β、TLR-4表達可以作為臨床預測早期胃癌Hp感染的預測指標。

Hp在患者胃黏膜損傷中屬于一種攻擊性因子，一旦革蘭陰性菌發生繁殖和崩解會釋放大量的脂多糖，將免疫系統激活，發揮著雙重作用：一方面對感染有一定的抵御作用；另一方面是對組織產生一定的損傷[10-11]。Hp感染導致癌癥發生的途徑較多，主要是加快硝酸鹽向亞硝酸鹽轉變進程，從而將胃黏膜環境改變，產生大量的細胞毒素相關基因A（CagA）、空泡毒素A（VacA）等毒性物質[12]。

研究數據顯示，在腫瘤細胞中有TLRs表達，TLRs信號參與腫瘤免疫逃逸、發展過程，與機體炎癥反應及免疫調節相關[13]。TLR-4主要存在于巨噬細胞、自然殺傷細胞、淋巴細胞等多種免疫細胞表面，發揮免疫作用。本研究中陽性、陰性早期胃癌患者血清TLR-4表達較高，其中陽性早期胃癌患者TLR-4表達高于陰性早期胃癌患者，提示早期胃癌患者TLR-4表達異常是導致早期胃癌患者Hp感染的危險因素，增加Hp感染風險。胃癌細胞不斷增殖會導致大量正常細胞發生壞死和凋亡，釋放大量的TLRs配體，TLRs會對腫瘤細胞產生刺激，死亡細胞發生“sterile”炎癥反應，導致患者病情不斷發展[14-15]。Li等[16]研究認為，在胃黏膜細胞表面存在的TLR4 mRNA能激活Hp的脂多糖介導轉換生長因子β活化酶發生磷酸化，提示Hp通過調節TLR4信號轉導，引起慢性萎縮性胃炎胃黏膜表面上皮細胞壞死速度加快。本研究ROC分析顯示TLR-4預測早期胃癌Hp感染的AUC達0.721，敏感度和特異度分別為92.50%、57.40%，提示血清TLR-4可用于評估早期胃癌Hp感染發生風險。

在腫瘤研究結果中，GSK-3β在Wnt/β-catenin、PI3K/Akt等信號通路中均有重要的參與作用，對磷酸化/去磷酸化過程發揮活性調節作用[17-18]。也有研究指出GSK-3β具有雙向調節作用，GSK-3β通過調節p53基因促進腫瘤細胞凋亡，對正常細胞生長有一定的抑制作用；此外，通過對維持NF-κB表達，抑制腫瘤細胞生長，促進正常細胞生長[19]。本研究陽性胃癌患者血清GSK3β表達低于陰性胃癌患者和對照組，且GSK3β表達與早期胃癌患者Hp感染存在密切關系，提示血清CysC水平升高是導致早期胃癌患者Hp感染的危險因素。楊學麗等[20]研究指出，GSK3β低表達對胃癌細胞增殖有明顯的促進作用，加快解聚APC/GSK3β/β-catenin復合物，造成β-catenin在細胞核內不斷積聚、活化，導致胃癌不斷轉移、浸潤。本研究ROC曲線分析顯示GSK3β預測早期胃癌Hp感染的AUC達0.745，提示GSK3β是早期胃癌Hp感染的警示指標。

本文Spearman研究結果證實，TLR-4表達水平與Hp感染呈負相關。蔡兆根等[21]研究指出，在Hp感染胃黏膜上皮組織中TLR4陽性表達占83.53%，提示Hp感染與TLR4呈正相關，提示胃癌患者Hp感染伴隨TLR-4介導機體免疫應答發生。本文研究結果與其研究不一致，分析原因，本文旨在研究早期胃癌患者血清中TLR-4表達水平變化狀況，未研究患者免疫組化狀況。本文中，GSK3β表達水平與Hp感染呈正相關。

綜上所述，早期胃癌Hp感染患者GSK3β、TLR-4表達異常，GSK3β、TLR-4表達水平高低與Hp感染具有相關性，GSK3β、TLR-4是早期胃癌Hp感染的風險預測因子。