手參愈傷組織培養(yǎng)及再生體系建立的研究進(jìn)展

摘 "要：手參屬于蘭科的手參屬植物，是一門名貴的蒙藥材，亦是中醫(yī)與藏醫(yī)常用的藥材。但因?yàn)槠湟吧Y源稀缺并且過度采挖，無法滿足市場(chǎng)需求，組織培養(yǎng)技術(shù)具有繁殖系數(shù)高，育種周期短，經(jīng)濟(jì)方便等優(yōu)點(diǎn)，故建立一套有效的手參組織培養(yǎng)技術(shù)以提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值是至關(guān)重要的。該文綜述關(guān)于手參組織培養(yǎng)及再生體系建立等方面的研究進(jìn)展，包括外植體的選擇，培養(yǎng)基和激素的配置，以及在組培過程中會(huì)出現(xiàn)的污染與褐化等問題，以期為手參的深入研究提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：手參；外植體；消毒處理；組織培養(yǎng)；愈傷組織

中圖分類號(hào)：S4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A " "文章編號(hào)：2096-9902（2023）03-00５３-0５

Abstract： Gymnadenia conopsea belongs to the genus Gymnadenia Ginseng of Orchidaceae. It is a valuable Mongolian medicine and a commonly used medicine in traditional Chinese medicine and Tibetan medicine. However， due to its scarcity of wild resources and over-mining， it cannot meet the market demand. The tissue culture technology has the advantages of high reproduction coefficient， short breeding cycle， economic convenience and so on. Therefore， it is very important to establish a set of effective tissue culture techniques of Gymnadenia conopsea to improve its economic value. This paper reviews the research progress on tissue culture and the establishment of regeneration system of Gymnadenia conopsea， including the selection of explants， the configuration of culture medium and hormones， and the problems of pollution and browning in the process of tissue culture， in order to provide a reference basis for the further study of Gymnadenia conopsea.

Keywords： Gymnadenia conopsea; explants; disinfection treatment; tissue culture; callus

手參（Gymnadenia conopsea （L.） R. Br.），又稱手掌參、佛手參和手兒參等，蒙藥名額日和藤乃一嘎日，異名旺拉嘎。屬蘭科多年生草本植物手參的塊莖，本品味甘、澀，性重、膩、軟、稀、鈍、溫。有益精壯陽(yáng)，治遺精之功效。主治腎寒、腰腿酸痛、遺精、滑精、陽(yáng)痿、巴木病、游痛癥、陶賴、赫如虎和身體虛弱。生于林間草地、河谷及灌木叢中。分布于東北、華北、西北及四川、云南、西藏等地[1-4]。在自然環(huán)境中，手參主要靠分蘗方式繁殖，可操作性差，繁殖系數(shù)低；因發(fā)芽率低、種子休眠期長(zhǎng)，通常不能通過種子繁殖。近年來，隨著野生資源不斷被采挖，數(shù)量日趨減少，遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求。目前手參已被《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》（CITES）附錄（2013版）列為Ⅱ級(jí)珍稀瀕危植物[5]；被《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄》（1999版）列為國(guó)家Ⅱ級(jí)保護(hù)植物；被《中國(guó)物種紅色名錄》（植物部分）評(píng)定為“瀕危”級(jí)別。組織培養(yǎng)技術(shù)具有繁殖系數(shù)高、育種周期短和經(jīng)濟(jì)方便等優(yōu)點(diǎn)[6]，無疑是解決手參資源稀缺問題的有效方法，對(duì)其種質(zhì)資源保護(hù)和可持續(xù)利用具有重要意義。因此，通過在大量文獻(xiàn)調(diào)研的基礎(chǔ)上，對(duì)手參愈傷組織誘導(dǎo)及再生體系建立研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為手參的合理利用和深度研究提供參考。

1 "手參的種胚培養(yǎng)

1.1 "胚齡和種子成熟度的篩選

高曉玲等[7]選用1～4月胚齡的幼果經(jīng)消毒處理后進(jìn)行胚培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個(gè)月胚齡對(duì)于手參胚的萌發(fā)和成苗最為有利。丁蘭等[8]選取綠色、飽滿的未成熟果莢或未開裂的成熟果莢等3種不同階段的種子，經(jīng)消毒處理后，撒播在培養(yǎng)基上，結(jié)果表明，成熟佛手參種子難以萌發(fā)，而未成熟種子具有萌發(fā)能力，萌發(fā)率可達(dá)到20%；Nabieva等[9]也通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)成熟的種子不具備萌發(fā)的能力，而未成熟的種子則能長(zhǎng)成幼苗。

1.2 "種胚消毒處理方法

種胚消毒處理方法見表1。

1.3 "種胚培養(yǎng)基

高曉玲等[7]共選擇了MS、1/2MS、PT、N6、Kundson C和G3 6種常用的培養(yǎng)基進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在G3和N6培養(yǎng)基上的萌發(fā)率及成苗率較低，然而在MS、1/2MS、Kundson C和PT培養(yǎng)基上手參的成苗率及萌發(fā)率相對(duì)較高。PT培養(yǎng)基的成本相對(duì)較低，因此選擇為最適合萌發(fā)培養(yǎng)基。以PT培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基試驗(yàn)添加10%果蔬提取物和1%活性炭，對(duì)手參胚的萌發(fā)率、萌發(fā)期、成苗率和成苗期4個(gè)參數(shù)進(jìn)行觀察。最后發(fā)現(xiàn)總體促進(jìn)效果最佳的是添加10%馬鈴薯提取物的培養(yǎng)基，在添加1%活性炭后其主要的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在成苗期縮短，與對(duì)照相比縮短了5 d。丁蘭等[8]以1/2MS作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基， 附加種類和濃度不同的植物生長(zhǎng)物質(zhì)， 并添加20 g/L蔗糖、200 mL/L椰汁、5.0 g/L瓊脂及1.0 g/L活性炭， 培養(yǎng)基pH調(diào)至5.6。結(jié)果發(fā)現(xiàn)最適萌發(fā)培養(yǎng)基為1/2MS+1.0～2.0 mg/L KT+0.1 mg/L NAA+10.0 mg/L腺嘌呤。Nabieva等[9]選擇Kundson（Kn）、1/3MS和Harvais（Har）3種培養(yǎng)基培養(yǎng)種子，所有營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基都添加了0.1 mg/L NAA、1.0 mg/L 2異戊烯基腺嘌呤 （2iP）和10%椰子水，瓊脂從10 g/L減少到6 g/L，蔗糖從30 g/L減少到10 g/L，pH調(diào)節(jié)至5.6。種子在24 h的暗光周期中發(fā)芽約6～8周后在1/3MS培養(yǎng)基中獲得幼苗。

2 "手參愈傷組織培養(yǎng)

2.1 "外植體的選擇

植物組織培養(yǎng)過程中外植體的選取既是基礎(chǔ)環(huán)節(jié)也是能否培育出合格幼苗的核心步驟[10]。植物所有器官組織均具備成長(zhǎng)為完整植株的能力，然而在不同組織中，其再生分化的能力存在差異[11]。李蒙飛等[12]將葉片、根尖、花梗、莖尖和腋芽作為外植體，結(jié)果不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)率有差異，其中，以莖尖誘導(dǎo)率最高，且愈傷組織形成的平均天數(shù)也最短，為12 d；葉片、根尖無愈傷組織形成。彭克忠等[13]將莖尖、根尖和側(cè)芽接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，結(jié)果根尖嚴(yán)重褐化，失去誘導(dǎo)愈傷組織的能力；且莖尖和側(cè)芽上均產(chǎn)生愈傷組織，但其誘導(dǎo)率有差異。其中，誘導(dǎo)率最高的是莖尖外植體。顧地周等[14]通過體胚誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)表示手參莖尖較適宜胚性愈傷組織及胚性細(xì)胞復(fù)合體誘導(dǎo)。楊爽等[15]利用秋天采收的野生手掌參的腋芽展開了不同因素對(duì)外植體褐變影響的實(shí)驗(yàn)。金洪等[16]選擇塊根、不定根、莖段、花序軸、子房、葉鞘、葉片和芽部作為外植體，唯一獲得成功的外植體為芽部，筆者表示該部位實(shí)際是頂芽和縮短的莖。而其他外植體均先后褐變死亡，無明顯分化跡象。

2.2 "外植體消毒處理方法

植物組織培養(yǎng)過程中，獲得無菌外植體是組織培養(yǎng)成功的必要前提[17]，外植體帶菌會(huì)直接導(dǎo)致污染現(xiàn)象發(fā)生[18]。因此，通過實(shí)驗(yàn)篩選出合適的消毒試劑及其時(shí)間組合，在盡量減少對(duì)外植體組織傷害的同時(shí)保持材料本身活力，在此情況下將附著于外植體表面的微生物完全消殺。當(dāng)前在組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)過程中常用的消毒試劑主要有升汞、乙醇和次氯酸鈉等[19]。各種試劑的消毒效果和清洗的難易程度各有不同：乙醇滲透性較強(qiáng)，但消毒作用十分有限；升汞的殺菌效果最強(qiáng)，但使用后難以清洗，易引起外植體褐化，且不利于環(huán)保；次氯酸鈉消毒較溫和，容易清除，對(duì)外植體傷害較小[17]。手參不同外植體消毒處理方法見表2。

2.3 "基本培養(yǎng)基與外源激素

培養(yǎng)基是決定植物組織培養(yǎng)成功與否的主要因素之一[17]。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可影響和有效調(diào)控植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，通常由人工合成的或從微生物中提取，其生理和生物學(xué)效應(yīng)與植物激素類似，在組織培養(yǎng)中有著至關(guān)重要的作用[18]。

2.3.1 "誘導(dǎo)培養(yǎng)基

李蒙飛等[12]以MS作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別單獨(dú)添加低濃度NAA和低濃度2，4-D或?qū)⒌蜐舛?-BA與NAA和2，4-D組合添加，所有培養(yǎng)基添加20 g/L蔗糖、6 g/L瓊脂和0.5 g/L水解酪蛋白，pH調(diào)至5.8。發(fā)現(xiàn)MS+0.5 mg/L NAA的培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)率最高，附加1.0 mg/L 2，4-D的最低，并表示生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素組合添加時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率要低于單獨(dú)添加生長(zhǎng)素。彭克忠等[13]以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑：?jiǎn)为?dú)添加2，4-D和NAA，濃度分別都是0.10、0.25、0.50、0.75和1.00 mg/L；組合添加2，4-D和6-BA，濃度為2，4-D 0.50 mg/L+6-BA 0.10 mg/L；組合添加NAA和6-BA，濃度為NAA 0.50 mg/L+6-BA0.10 mg/L。結(jié)果表明MS+NAA 0.50 mg/L培養(yǎng)基中手參愈傷組織誘導(dǎo)率最高（59.5%），MS+2，4-D 1.00 mg/L培養(yǎng)基中手參愈傷組織誘導(dǎo)率最低。同一濃度下，生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素組合添加時(shí)的手參愈傷組織誘導(dǎo)率要低于單獨(dú)添加生長(zhǎng)素。顧地周等[14]以CM為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的6-BA、IAA、NAA和2，4-D，附加蔗糖分別為20 g/L，瓊脂8.0 g/L，pH為5.5。為了提高手參胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率和速度，采用均勻設(shè)計(jì)法，同時(shí)考察了細(xì)胞分裂素6-BA和生長(zhǎng)素IAA、NAA和2，4-D的濃度交叉配比對(duì)誘導(dǎo)率的影響；最終得出CM+6-BA 1.0 mg/L+IAA 2.0 mg/L+2，4-D 0.1 mg/L是手參幼莖尖誘導(dǎo)含胚性細(xì)胞復(fù)合體的胚性愈傷組織最佳培養(yǎng)基。

2.3.2 "增殖培養(yǎng)基

李蒙飛等[12]將初代培養(yǎng)的愈傷組織轉(zhuǎn)接到MS附加濃度0.5、0.4、0.3、0.2和0.1 mg/L NAA的增殖培養(yǎng)基上（添加20 g/L蔗糖、6 g/L瓊脂（產(chǎn)地：北京）和0.5 g/L水解酪蛋白，pH調(diào)至5.8），培養(yǎng)42 d后觀察發(fā)現(xiàn)，在MS附加0.1 mg/LNAA的培養(yǎng)基上愈傷組織生長(zhǎng)旺盛；而在其他4組培養(yǎng)基上愈傷組織增殖較緩慢。丁蘭等[8]以1/2MS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，附加種類和濃度不同的植物生長(zhǎng)物質(zhì)，并添加20 g/L蔗糖、200 mL/L椰汁、5.0 g/L 瓊脂及1.0 g/L活性炭，培養(yǎng)基pH 為5.6。結(jié)果發(fā)現(xiàn)原球莖（根狀莖）增殖最適培養(yǎng)基為1/2MS+3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+10.0 mg/L腺嘌呤。

3 "手參再生體系的建立

3.1 "不定芽的誘導(dǎo)

高曉玲等[7]選擇MS、1/2MS和PT培養(yǎng)基，分別組合添加0.2 mg/L NAA和0.1、0.4、0.8 mg/L 3種濃度的6-BA，所有培養(yǎng)基添加蔗糖30 g/L，瓊脂糖濃度為0.7%。結(jié)果表示，MS+0.2 mg/L NAA+0.6 mg/L 6-BA組合對(duì)于芽的誘導(dǎo)和增殖效果最好，且提高6-BA的濃度可持續(xù)促進(jìn)叢生芽的形成，但在濃度超過0.4 mg/L后，芽的繼代增殖能力出現(xiàn)下降。因此，6-BA的最適濃度應(yīng)控制在0.4 mg/L左右最有利于誘導(dǎo)莖尖出芽。

金洪等[16]得出以下3種芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，蔗糖濃度為3.5%，瓊脂為0.8%，pH為6.5：①M(fèi)S+KT 0.5 mg/L+NAA 1 mg/L+ZT 0.5 mg/L+VC 1 mg/L；②MS+KT 1 mg/L+NAA 0.5 mg/L+ZT 0.5 mg/L+VC 1 mg/L；③MS+KT 0.5 mg/L+NAA 1 mg/L+ZT 0.5 mg/L+2，4-D 1 mg/L+VC 1 mg/L。李蒙飛等[12]以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基附加濃度0.1、0.5、1.0 mg/L的TDZ和6-BA；組合添加0.1 mg/L TDZ和NAA；組合添加1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA，所有培養(yǎng)基添加20 g/L蔗糖、6 g/L瓊脂（產(chǎn)地：北京）和0.5 g/L水解酪蛋白，pH調(diào)至5.8。結(jié)果表明，附加0.1 mg/L TDZ上的愈傷組織14 d出現(xiàn)芽點(diǎn)，0.1 mg/L 6-BA上的最晚，為21 d左右；隨TDZ濃度增加，芽分化率明顯降低；而6-BA對(duì)芽分化的影響，則隨濃度的增加而增加。丁蘭等[8]在將根狀莖和愈傷組織在繼代多次后發(fā)現(xiàn)1/2MS+1.0 mg/L KT+10.0 mg/L腺嘌呤（附加2 g/L蔗糖、200 mg/L椰汁、5.0 g/L瓊脂及1.0 g/L活性炭，培養(yǎng)基pH為5.6）為芽分化最適培養(yǎng)基。

3.2 "生根培養(yǎng)基

金洪等[16]得出以下2種生根培養(yǎng)基（蔗糖濃度為3.5%，瓊脂為0.8%，pH為6.5）：MS+NAA 1 mg/L+VC 0.5 mg/L；MS+IAA 2 mg/L+VC 0.5 mg/L。李蒙飛等[12]選取MS和1/2MS 2種培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別附加0.1、0.5、1.0 mg/L NAA（添加20 g/L蔗糖、6 g/L瓊脂（產(chǎn)地：北京）、0.5 g/L水解酪蛋白，pH調(diào)至5.8）。將不定芽從基部切下，轉(zhuǎn)接到以上2個(gè)生根培養(yǎng)基中，結(jié)果表明，1/2MS+0.5 mg/L NAA的誘導(dǎo)率最高。

4 "褐化現(xiàn)象

植物組織培養(yǎng)中，外植體受自身分泌的酚類化合物的影響導(dǎo)致褐變褐化的現(xiàn)象稱為褐化現(xiàn)象，外植體之后的分化和再生芽會(huì)被嚴(yán)重影響，最終走向死亡[10]。褐化、污染和玻璃化是植物組織培養(yǎng)過程中的3大難題，但褐化相對(duì)于污染和玻璃化更難控制[20]。褐化產(chǎn)生的原因主要分為2種：一是由于細(xì)胞受到不利條件影響造成細(xì)胞死亡而形成的褐化現(xiàn)象。二是由于酚類物質(zhì)被多酚氧化酶氧化激活[21]，發(fā)生氧化反應(yīng)后生成一種醌類物質(zhì)，逐漸向外植體材料四周擴(kuò)散，形成褐化。

李蒙飛[22]選取花梗、莖尖、嫩葉、根尖和腋芽作為外植體，消毒滅菌之后（見表2），開展了“不同類型外植體褐變的差異”“培養(yǎng)基類型及培養(yǎng)方式對(duì)褐變的影響”和“不同附加成分對(duì)抑制外植體褐化的影響”3項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，莖尖褐化率最低；在MS和1/2MS比較實(shí)驗(yàn)中，以無機(jī)鹽濃度較低的l/2MS培養(yǎng)基較好。固體培養(yǎng)基相較于液體培養(yǎng)基分化率會(huì)更好，液體培養(yǎng)對(duì)外植體褐化有著明顯抑制作用；在培養(yǎng)基中加入聚乙烯毗咯烷酮（PVP）、硫代硫酸鈉、活性炭和維生素C等附加成分，褐化現(xiàn)象都能不同程度的減輕，其中以PVP效果最好。彭克忠等[13]發(fā)現(xiàn)手參組織培養(yǎng)中外植體的褐化現(xiàn)象非常嚴(yán)重，導(dǎo)致愈傷組織無法形成。在所選外植體中根尖的褐化率最高，為100.0%；側(cè)芽次之；莖尖的褐化率最低，為38.5%。楊爽等[15]展開了消毒劑和消毒時(shí)間、活性炭濃度、ＶＣ使用方法和濃度、暗培養(yǎng)時(shí)間、光照強(qiáng)度及轉(zhuǎn)屏間隔時(shí)間等因素對(duì)手參外植體褐化及腋芽萌動(dòng)生長(zhǎng)的影響的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，外植體均采用75%的酒精處理20 s與0.1%的升汞處理10 min相結(jié)合的消毒方法效果顯著；活性炭濃度以添加1 g/L活性炭的處理效果最好。活性炭濃度在一定范圍內(nèi)有利于抑制褐變，但濃度過高反而會(huì)吸附對(duì)外植體分化發(fā)育有益的物質(zhì)，從而抑制腋芽的萌動(dòng)生長(zhǎng)，帶來副效應(yīng)；VC濃度實(shí)驗(yàn)以培養(yǎng)基中添加2 mg/L VC的處理最優(yōu)，外植體的褐化率最低，外植體的褐化程度最輕；實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，暗培養(yǎng)5～10 d比直接光照培養(yǎng)好，褐化較輕，腋芽萌動(dòng)時(shí)間早、長(zhǎng)勢(shì)較快；光照強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2 000 lx為最優(yōu)光照條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示縮短轉(zhuǎn)瓶間隔時(shí)間可減輕手參芽的褐化程度，提高芽的生長(zhǎng)質(zhì)量。以3 d轉(zhuǎn)瓶１次褐化程度最輕，腋芽萌動(dòng)生長(zhǎng)情況最好。

5 "結(jié)束語

本文整理了手參種胚培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和再生體系建立時(shí)所用到的實(shí)驗(yàn)條件和方法。其中包括胚齡、外植體選擇、消毒處理方法、各階段的培養(yǎng)基和外源激素條件及褐變問題。種子培養(yǎng)中各學(xué)者一致認(rèn)為未成熟種子較成熟種子而言更具有誘導(dǎo)能力。外植體選擇中也一致表明莖尖部位的愈傷誘導(dǎo)率最高，并且褐化率最低。消毒處理方法大多采用75%酒精與0.1%氯化汞的組合消毒，但是具體消毒時(shí)間有差異。各階段的培養(yǎng)基和外源激素的組合除了基本培養(yǎng)基大多采用MS培養(yǎng)基之外并沒有很高的一致性，這也許是因?yàn)檫x擇的外植體不是同一種部位所導(dǎo)致，也有學(xué)者考慮成本從而選擇PT培養(yǎng)基。前人的研究多數(shù)是將重點(diǎn)放在了手參組培的培養(yǎng)基的設(shè)置及外植體的挑選與滅菌上，距離手參的最佳高效商品化生產(chǎn)的方案顯然有一定差距。若要進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，仍然需要開展進(jìn)一步的研究工作，如手參再生植株的煉苗、愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)中褐變的控制和降低培養(yǎng)成本等，仍然有許多問題。未來人們的研究重點(diǎn)可以注重除莖尖外其他外植體的培養(yǎng)，因?yàn)椴扇∏o尖部位對(duì)于母株傷害很大，并不適合作為長(zhǎng)期誘導(dǎo)培養(yǎng)的最適外植體；也可以注重外植體褐化的機(jī)制研究、手參再生植株的馴化移栽，在實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，也可以對(duì)培養(yǎng)基及培養(yǎng)方式進(jìn)行大膽革新，逐步完善手參組培技術(shù)與快繁體系。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國(guó)家中醫(yī)藥管理局.中華本草·蒙藥卷[M].上海：上海科技出版社，2004：124-125.

[2] 蒙醫(yī)學(xué)編輯委員會(huì).中國(guó)醫(yī)學(xué)百科全書（蒙醫(yī)學(xué)）[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1992：228.

[3] 白清云.中國(guó)醫(yī)學(xué)百科全書·蒙醫(yī)學(xué)（上）[M].赤峰：內(nèi)蒙古科學(xué)技術(shù)出版社，1987：597-598.

[4] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·蒙藥分冊(cè)[S]．2000：138.

[5] 周繇.長(zhǎng)白山區(qū)野生珍稀瀕危藥用植物資源評(píng)價(jià)體系的初步研究[J].西北植物學(xué)報(bào)，2006（3）：599-605.

[6] KULDEEP S Y，NARENDER S，SHARUTI V.Plant tissue culture： a biotechnological tool for solving the problem of propagation of multipurpose endangered medicinal plants in India[J].International Journal of Agricultural Technology，2012，8：305-318.

[7] 高曉玲，馮鴻.手參組織培養(yǎng)和植株再生技術(shù)研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，25（5）：1841-1844.

[8] 丁蘭，張麗，郭柳，等.瀕危植物佛手參種子的非共生萌發(fā)及種苗的快速繁殖[J].植物生理學(xué)報(bào)，2014，50（1）：77-82.

[9] NABIEVA A，ZHMUD E，ZAYTSEVA Y.Initial stages of Gymnadenia conopsea（Orchidaceae） morphogenesis in in vitro culture [C]//BIO Web of Conferences， EDP Sciences， 2020.

[10] 王少翠，杜歡歡，戴希堯，等.我國(guó)多肉植物組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].河北北方學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2022，38（7）：25-29.

[11] 郭蕾，李濟(jì)武，劉衛(wèi)紅，等.石楠屬植物組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].河南林業(yè)科技，2022，42（3）：44-46.

[12] 李蒙飛，劉建軍.手參愈傷組織培養(yǎng)及植株再生[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，29（6）：110-113.

[13] 彭克忠，劉燕云，蘭常軍，等.不同外植體類型和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)手參組培的影響[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2021（7）：62-64.

[14] 顧地周，馮穎，顧美影，等.基于均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化手參體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生體系[J].中草藥，2010，41（6）：989-993.

[15] 楊爽，方江平，王勇.手掌參組織培養(yǎng)中外植體褐化的影響因素研究[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（1）：22-25.

[16] 金洪，王俊杰，張眾，等.手掌參的組織培養(yǎng)研究[J].內(nèi)蒙古農(nóng)牧學(xué)院學(xué)報(bào)，1995（2）：74-77.

[17] 王蒂，陳勁松.植物組織培養(yǎng)[Ｍ].2版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2013，8：24-25.

[18] 陳振光．園藝植物離體培養(yǎng)學(xué)[Ｍ]．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1996．

[19] 穆玉珍，朱美瑤.蘭花組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代園藝，2021，44（1）：24-26.

[20] 孔祥生，張妙霞，杜愛玲，等．甜柿離體快繁技術(shù)研究[Ｊ]．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998（2）：83-91．

[21] 祁建國(guó)．植物組織培養(yǎng)中常見問題與對(duì)策[Ｊ]．現(xiàn)代園藝，2012（16）：197.

[22] 李蒙飛.手參愈傷組織培養(yǎng)及植株再生研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2014.