基于GC-TOF-MS的大黃魚魚卵魚露快速發酵過程中代謝產物分析

周 靜，張華丹，火玉明，雷彩玲，杜希萍，梁 鵬,*，程文健，陳麗嬌

（1.福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002；2.閩臺特色海洋食品加工及營養健康教育部工程研究中心，福建 福州 350002；3.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建 廈門 361021）

魚露制品因其獨特的香氣和口感深受消費者歡迎。研究表明，魚露富含人體所需的必需氨基酸、多種礦物質元素和維生素等營養成分，此外，魚露還具有降血壓、降低膽固醇、抗氧化等生理功效[1]。傳統魚露工藝是由低價值魚類或加工過的魚類廢棄物與鹽混合制成，通過水解和微生物發酵，發酵過程通常需要6～18 個月[2]。并且可能會產生讓人難以接受的不良氣味。因此，近年來國內外學者研究出外加酶、外加曲和保溫發酵等快速發酵技術[3]，如Nguyen等[4]從魚露發酵池中分離了SPQ耐鹽桿菌（Marinococcus halotoleransSPQ）并接種到鳳尾魚魚露的發酵液中進行發酵。結果表明在接種后第6個月的培養液中氨基酸態氮質量濃度為2.52 g/L，高于對照組的2.21 g/L，組胺質量濃度為110.12 mg/L，低于200 mg/L的最大允許安全限值，天冬氨酸和谷氨酸分別增加23.5%和35.1%。Lopetcharat等[5]通過研究發現，太平洋鱈魚魚露在50 ℃條件下進行發酵，魚露中總氮含量在15 d時就達到了商售魚露的水平，說明保溫發酵可以加快魚露的成熟。Rabie等[6]以鯖魚為原料，添加菠蘿蛋白酶制備魚露，在不影響產品質量的前提下將魚露的發酵時間縮短至90 d。由此可見，快速發酵工藝不僅可以縮短傳統魚露的發酵周期，還可以改善魚露的風味、提高魚露的品質。大黃魚是我國重要的海水養殖魚類之一，其加工副產物魚卵因富含二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosapentaenoic acid，DHA）以及人體所需的多種營養物質，具有較高的開發利用價值[7]。有望作為魚露發酵的優質原料，但目前這方面的研究較少。

代謝組學包括核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技術、氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用技術和液相色譜-質譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）聯用技術等[8]。與其他技術相比，色譜-質譜技術具有靈敏度高、分辨率高等優點，而發酵食品中含有多種小分子代謝物，極性跨度大，并表現出較大的集中動態范圍[9]。因此色譜-質譜技術在發酵代謝產物分析方面具有一定的優勢，有望用于分析發酵食品加工過程中代謝產物組成及其形成機制。如李文亞等[10]采用GC-MS技術對不同溫度下的低鹽蝦醬發酵過程中的代謝物進行監測，結果表明與傳統蝦醬相比，10 ℃下發酵的低鹽蝦醬不僅含鹽量降低，而且營養特性較高。Lin Fengke等[11]基于氣相色譜-飛行時間質譜（gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry，GCTOF-MS）技術對來自中國西南部的本土發酵食品——老窩火腿發酵過程中的代謝產物進行分析，結果表明大多數氨基酸的相對含量在成熟兩年的老窩火腿樣品中最高，食用老窩火腿有助于人類飲食的微生物和化學多樣性。He Yingxia等[12]將GC-TOF-MS技術與描述性感官分析相結合，分析中國不同地區的濃香型白酒的差異，結果表明58種香氣化合物在四川和江淮地區的樣品中存在顯著差異，揭示此方法在其他酒精飲料的風味表征中可能有積極應用。

近年來，課題組在大黃魚魚卵魚露發酵工藝方面開展相關研究工作，如周靜等[13]通過對大黃魚魚卵進行快速發酵，得出15%加鹽量、15%加曲量、35 ℃為大黃魚魚卵魚露發酵的適宜工藝條件。而當前采用代謝組學技術在魚卵魚露發酵品質方面的研究較少，大黃魚魚卵魚露發酵過程中的代謝產物及其參與的代謝通路尚不明確。因此本實驗以大黃魚魚卵為魚露發酵原料，采用外加酶、外加曲、保溫發酵相結合的方法快速發酵獲得大黃魚魚卵魚露制品，并嘗試采用代謝組學技術系統地揭示大黃魚魚卵魚露發酵過程中形成的代謝產物及其代謝通路與形成機制，旨在為我國魚露發酵行業的發展提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大黃魚魚卵 福建蔡氏水產有限公司；木瓜蛋白酶（酶活力為8×105U/g） 北京索萊寶科技有限公司；黑曲精 上海佳民釀造食品有限公司；米曲精 濟寧玉園生物科技有限公司；鹽、豆粕、麩皮 市購；甲醇、乙腈、異丙醇 美國賽默飛世爾科技有限公司；甲氧胺 美國Sigma公司；雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺（bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide，BSTFA） 梯希愛（上海）化成工業發展有限公司。

1.2 儀器與設備

H1850-R冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；QL-866混勻儀 Vortex Mixer公司；5305真空濃縮儀 美國Eppendorf公司；DHG-9240鼓風干燥箱上海一恒科學儀器有限公司；7890B氣相色譜儀 美國Agilent公司；Pegasus BT質譜儀 美國LECO公司。

1.3 方法

1.3.1 曲霉的制備

復合曲由黑曲霉和米曲霉組成，質量比為1∶3[14]。

黑曲霉制備：以豆粕和麩皮（質量比為豆粕∶麩皮=3∶1）為發酵基料，80%（水/干料）的去離子水潤濕20 min，高壓滅菌鍋120 ℃蒸煮20 min，黑曲霉接種量為0.3%，在30 ℃下培養48 h[14]。

米曲霉制備：以豆粕和麩皮（質量比為豆粕∶麩皮=2∶1）為發酵基料，80%（水/干料）的去離子水潤濕20 min，高壓滅菌鍋120 ℃蒸煮20 min，米曲霉接種量為0.3%，在30 ℃下培養44 h[14]。

1.3.2 魚露發酵工藝

將100 g大黃魚魚卵解凍后剪碎，加入300 g的去離子水（質量比為魚卵∶水=1∶3），邊攪拌邊將pH值調至6.5，加入3 g（魚卵質量3%）的木瓜蛋白酶后將混合液放入50 ℃的水浴鍋中酶解4 h（每隔半小時攪拌1 次），酶解結束后放入90 ℃水浴鍋中滅酶15 min，拿出后冷卻至室溫，加入酶解液質量15%的復合曲、15%的鹽，放入35 ℃的保溫箱發酵，每天攪拌1 次，并且每隔5 d取樣1 次（依次命名樣本K-5、K-10、K-15、K-20、K-25、K-30）。

1.3.3 代謝物處理

1）將樣品充分振蕩混勻后，精確移取樣本500 μL于2 mL EP管中，準確加入500 μL乙腈-異丙醇-水（3∶3∶2，V/V）混合溶液溶液（－20 ℃），渦旋振蕩30 s。2）室溫超聲5 min。3）14 000 r/min離心5 min，取上清液500 μL溶液加入到一新的2 mL EP管中，真空濃縮儀濃縮至盡干（8～10 h），剩余濃縮的上清液放置－80 ℃冰箱備用。4）在濃縮盡干的樣品中，加入80 μL的20 mg/mL甲氧胺吡啶溶液復溶，渦旋振蕩30 s，60 ℃孵育60 min。5）再最后 加入100 μL BSTFA-TMCS（99∶1，V/V）衍生化試劑，渦旋振蕩30 s，70 ℃條件下孵育90 min，14 000 r/min離心3 min，取上清液90～100 μL加入到檢測瓶中。6）樣品放置于密封盅內暫存待測，并于24 h內完成GC-TOF上機檢測[15]。

1.3.4 檢測條件

GC條件：DB-5MS毛細管柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；升溫程序：初始溫度50 ℃，保持0.5 min，以15 ℃/min上升到320 ℃，320 ℃，保持9 min；載氣（氦氣）流速1 mL/min；進樣量1 μL；分流比1∶10；進樣口溫度280 ℃；傳輸線和離子源溫度分別為320 ℃和230 ℃。

MS條件：全掃描方法；掃描速率10 spec/s；電子能量－70 eV；溶劑延時3 min[16]。

1.4 數據處理

利用R（v3.3.2）的XCMS程序包進行峰識別、峰過濾、峰對齊，得到包括質核比和保留時間及峰面積等信息的數據矩陣；結合AMDIS程序進行代謝物的注釋，對數據進行峰面積的總峰面積歸一化。在對代謝組學數據進行多元統計分析之前，需要將數據進行標準化處理，使用的是帕萊托換算（Pareto scaling，Mean-centering and scaled to pareto variance，Par）。使用SIMCA-P(v13.0)進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA），通過R（v3.3.2）中pheatmap程序包對數據集進行縮放，得到代謝物相對定量值層次聚類圖。通過Metaboanalyst中的MetPA數據庫對差異代謝物的代謝通路進行分析。

2 結果與分析

2.1 大黃魚魚卵魚露發酵過程中代謝物多元統計分析

2.1.1 PCA結果

圖1 大黃魚魚卵魚露差異代謝物的PCA得分圖Fig. 1 PCA score plot of differential metabolites in large yellow croaker roe sauce

從圖1可觀察樣品的聚集、離散程度。不同樣品的分布點越靠近，說明這些樣品中所含有的變量（分子）的組成和濃度越接近；反之，樣品點越遠離，其差異越大。模型的可解釋度為0.506高于0.5，說明所得到的模型準確性較好。如圖1所示，K-5和K-10組內分別有一個樣品與其余2 個樣品之間存在一定的距離，可能是實驗存在的誤差導致。其余樣本的平行樣品都較為集中。此外，大黃魚魚卵魚露發酵5、10、15、20、25 d與30 d的大黃魚魚卵魚露樣本距離較遠，說明魚露發酵前期與后期的代謝產物差異較大，變化較為明顯。

2.1.2 OPLS-DA結果

圖2 大黃魚魚卵魚露差異代謝物的OPLS-DA得分圖Fig. 2 OPLS-DA score plot of differential metabolites in large yellow croaker roe sauce

2.2 大黃魚魚卵魚露發酵過程中差異代謝物的篩選

根據P值不大于0.05且變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值不小于1的篩選條件[18]判斷大黃魚魚卵魚露發酵過程中的明顯差異代謝物，一共得到46種。如表1所示，其中包括10種糖、9種醇、7種氨基酸、6種有機酸、4種酯、3種醛、1種脂肪酸以及6種其他化合物。通過對46種初級代謝物進行凝聚層次聚類熱圖分析得到圖3結果表明，大黃魚魚卵魚露發酵過程中代謝物被分為2 個大類，每個大類有2 個亞類，共4 個亞類。第1大類第1亞類有1種醛；第1大類第2亞類有24種，分別為6種糖、5種有機酸、5種醇、2種酯、1種醛、1種脂肪酸、1種氨基酸和3種其他化合物；第2大類第1亞類有19種，分別為6種氨基酸、4種醇、4種糖、1種醛、1種有機酸和3種其他化合物；第2大類第2亞類有2種酯。

糖類作為差異代謝物最多的種類，其中的葡萄糖如蜜二糖和3,6-脫水葡萄糖等作為魚露中的主要碳水化合物，隨著魚露發酵的進行，其含量在不斷下降，說明魚露的發酵過程在不斷消耗碳水化合物。D-木糖存在于動物的糖蛋白中，被廣泛應用于焙烤食品、水產品、臘肉、等產品的生產、加工中，并且可以改善肉制品的異味。且D-木糖具有活化人體腸道內的雙歧桿菌并促進其生長，改善人體的微生態環境，提高機體免疫力的功效[19]。魚露發酵過程中D-木糖的相對含量在發酵15 d及以后有所上升。6-脫氧己糖是由核苷二磷酸激活的己糖通過4-酮-6-脫氧中間物形成，6-脫氧己糖存在于脂多糖、胞外多糖、糖蛋白和不同種類的糖基化次生代謝產物中[20]。在魚露的發酵過程中，D-木糖和6-脫氧己糖的相對含量呈增加趨勢。說明發酵過程中魚露中的糖蛋白在不斷被消耗，從而產生D-木糖和6-脫氧己糖。

醇類物質中的植物鞘氨醇是神經酰胺的前體，同時也是皮膚脂質成分之一，Kim等[21]合成了植物鞘氨醇衍生物，并將其應用于小鼠成功證明其具有減輕炎癥性皮膚損傷的功能。麥芽糖醇是一種新型的功能性甜味劑，被人體吸收的比例較低，因此可作為糖尿病人的調味劑[22]。目前麥芽糖醇的主要來源是淀粉，因此魚露中的麥芽糖醇來源最有可能是米曲霉和黑曲霉的培養原料豆粕和麩皮。1-苯乙醇又名蘇合香醇，具有淡梔子花香味，是一種較為重要的食用香料用芳香化合物，被廣泛用于調配各種食用香精，也被認為是發酵食品的香味貢獻者。Dong Fang等[23]利用穩定同位素標記的方法，發現1-苯乙醇來源于苯丙氨酸通路中的苯乙酮，魚露發酵過程中的1-苯乙醇的相對含量不斷上升，30 d的相對含量較高，這與王潔茹等[24]對南疆紅棗醋香氣成分分析的研究結果類似。肌醇被認為是一種類似維生素的必需營養素，是大多數水生動物的生長因子。有研究報道，缺乏肌醇的蝦的消化和食物利用率較低，而隨著肌醇水平的增加，蝦體內的消化酶活性提高，消化能力和生長性能隨之提高[25]。

氨基酸作為魚露獨特口感的直接原因，在檢測到的46種明顯差異代謝物中有7種，分別是L-異蘇氨酸、DL-蘇氨酸、L-纈氨酸、L-異亮氨酸、L-苯丙氨酸和L-絲氨酸、DL-焦谷氨酸，其中有4種為人體必需氨基酸（苯丙氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、纈氨酸）。異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸為苦味氨基酸，蘇氨酸為甜味氨基酸，另外絲氨酸是魚露鮮味形成的關鍵氨基酸之一[26]。隨著發酵的進行，蘇氨酸的相對含量有所增加，而其余6種氨基酸的含量在不斷減少，這與Wang Yueqi等[9]對中國傳統魚露的代謝產物研究結果一致。

差異代謝物中的有機酸包括琥珀酸、丁烯二酸、異戊酸、2-{[(芐氧基)羰基]氨基}-4-甲基戊酸、D-阿拉伯酸、D-甘油酸，琥珀酸是鮮味的載體，能夠協同其他物質起到增強呈味的作用，是水產品重要的滋味物質之一[27]，琥珀酸（包括鹽類）可產生酸味、呈味，可用于豆醬、調味料等食品中。D-阿拉伯酸、D-甘油酸、琥珀酸、2-{[(芐氧基)羰基]氨基}-4-甲基戊酸、異戊酸和EPA都隨著發酵的進行含量不斷增加，特別是D-阿拉伯酸、D-甘油酸、2-{[(芐氧基)羰基]氨基}-4-甲基戊酸以及EPA在發酵第30天含量最高。

酯類是發酵生成的羧酸和醇的酯化作用的產物，存在于生的、烤的和發酵食品的揮發物以及甲殼類魚肉等海鮮中[28]。魚露發酵過程產生的差異代謝物中脂類有4種，分別為莽草酸酯、乙酸甲酯、壬酸甲酯以及2-氧代-4-甲基戊酸甲酯，這些酯質與其他物質相互作用，共同構成魚露的特殊風味。其中乙酸甲酯是國家規定食品中可食用的香精，主要呈味為果香。醛類在魚露的風味形成中也不可或缺。差異代謝物中的苯乙醛是由苯丙氨酸通過Strecker途徑降解生成，表現出玫瑰花香[29-30]。在魚露的發酵過程中，苯乙醛的含量不斷升高，說明魚露的香味成分在不斷形成。

魚露的差異代謝物中只檢測到1種多不飽和脂肪酸，即為EPA，其能預防老年癡呆癥和抗炎癥，有效降低心血管疾病的發病率，對人與動物的生長發育起著重要作用[31]。由圖3可以看出，EPA的相對含量在發酵過程中不斷增加，在發酵第30天相對含量較高。魚露中的其他化合物包括呋喃、酮和酚類化合物。呋喃是由美拉德反應或氨基酸的熱分解產物產生的，酮類與脂肪酸氧化有關。

表1 大黃魚魚卵魚露發酵過程中的顯著差異代謝物Table 1 Significantly differential metabolites in large yellow croaker roe sauce during fermentation

圖3 大黃魚魚卵魚露發酵過程中差異代謝物層次聚類分析熱圖Fig. 3 Heat map of hierarchical cluster analysis of differential metabolites in large yellow croaker roe sauce during fermentation

2.3 差異代謝物通路分析

KEGG是一個整合了基因組、化學和系統功能信息的數據庫，通路數據庫通過代謝通路濃縮和拓撲分析，識別出可能的受發酵時間段影響的代謝通路[32]。如圖4、表2所示，根據代謝通路影響值從大到小的代謝通路分別為纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成，蛋白質消化吸收，半乳糖代謝，氨酰-tRNA生物合成，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，硫代葡萄糖苷生物合成，三羧酸循環，氨基酸的生物合成，莽草酸類生物堿的生物合成，磷酸肌醇代謝，不飽和脂肪酸的生物合成。影響值分別為0.130 43、0.106 38、0.086 957、0.076 923、0.06、0.051 948、0.05、0.04 687 5、0.041 667、0.021 277、0.013 514。在所有代謝通路中，氨基酸的生物合成與其他代謝通路存在密切聯系。

圖4 大黃魚魚卵魚露差異代謝物的代謝通路影響因子圖Fig. 4 Metabolic pathways regulating differential metabolites in large yellow croaker roe sauce

如圖5所示，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成與甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝密切相關。表現為甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路中所產生的蘇氨酸經蘇氨酸脫水酶脫氨脫水形成α-酮丁酸，再和丙酮酸在乙酰乳酸合酶的作用下合成α-乙酰-α-羥丁酸，經乙酰乳酸變位酶/還原酶合成α,β-二羥-β-甲基戊酸，接下來經二羥酸脫水酶合成α-酮-β-甲基戊酸，結合谷氨酸在分支鏈氨基酸谷氨酸轉氨酶作用下最終合成異亮氨酸。纈氨酸和亮氨酸的合成首先由丙酮酸脫羧后與另一個丙酮酸縮合，形成α-乙酰乳酸。然后還原、變位、脫水形成α-酮異戊酸。這是一個分支點，如果轉氨可生成纈氨酸，否則就與乙酰輔酶A縮合，進入亮氨酸支路，形成α-酮異己酸再轉氨，即生成亮氨酸。

表2 大黃魚魚卵魚露發酵過程中代謝通路分析表Table 2 Metabolic pathway analysis of large yellow croaker roe sauce during fermentation

圖5 纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成途徑Fig. 5 Biosynthetic pathways of valine leucine and isoleucine

發酵環境中的淀粉水解成葡萄糖，通過糖酵解途徑生成丙酮酸。丙酮酸氧化脫羧后生成乙酰輔酶A進入三羧酸循環促進琥珀酸等有機酸的形成，促進魚露獨特風味的形成。丙酮酸與糖酵解的中間產物3-磷酸甘油醛縮合生成1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸（1-deoxy-D-xylose 5-phosphate，DXP），乙酰輔酶A生成β-羥基-β-甲基戊二酸單酰輔酶A（β-hydroxyl-β-methylglutaric acid monoacyl coenzyme A，HMG-CoA）。L-半乳糖-1-磷酸酯酶由DXP經MEP/DOXP途徑或HMG-CoA經甲羥戊酸途徑生成后進入萜生物堿類的代謝。

絲氨酸來源于糖酵解的中間體——3-磷酸甘油酸酯，甘氨酸來源于絲氨酸。蘇氨酸是一種動物無法合成的必需氨基酸，而在細菌和植物中，蘇氨酸來源于天冬氨酸。因此魚露中的蘇氨酸主要由發酵體系中的細菌以及植物產生。硫代葡萄糖苷生物合成代謝途徑中，原料來源分別為蛋氨酸、芳香族氨基酸、支鏈氨基酸3種。

其次，通過KEGG等權威代謝物數據庫對差異代謝物進行映射，反映出具有極顯著差異的代謝物有15 個[33]。分別為L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-絲氨酸、L-苯丙氨酸、肌醇、α-D-葡萄糖、半乳糖甘油、甘氨酸、DL-蘇氨酸、2-氧代-4-甲基戊酸甲酯、莽草酸酯、琥珀酸、EPA、甘油。從圖6可以直觀比較大黃魚魚卵魚露發酵過程中15種關鍵代謝物的相對含量差異。其中L-纈氨酸、L-異亮氨酸、L-絲氨酸、L-苯丙氨酸參與了蛋白質消化吸收，氨酰-tRNA生物合成，氨基酸的生物合成。L-苯丙氨酸、L-纈氨酸、L-異亮氨酸參與了硫代葡萄糖苷生物合成，甘氨酸、L-絲氨酸和DL-蘇氨酸參與了甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，L-纈氨酸、L-亮氨酸和L-異亮氨酸參與了纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成。氨基酸類的差異代謝物參與了多條代謝通路，說明氨基酸對于代謝通路的影響較大，同時也說明在大黃魚魚卵魚露發酵過程中，氨基酸的相對含量變化較大代謝助力了大黃魚魚卵魚露風味的形成。琥珀酸主要參與三羧酸循環和莽草酸類生物堿的生物合成，α-D-葡萄糖主要參與了半乳糖代謝和莽草酸類生物堿的生物合成，肌醇參與了磷酸肌醇代謝，EPA參與了不飽和脂肪酸的生物合成。

圖6 大黃魚魚卵魚露發酵過程中15種關鍵代謝物相對含量箱形圖Fig. 6 Box plots of relative contents of 15 key differential metabolites in large yellow croaker roe sauce during fermentation

3 結 論

基于GC-TOF-MS建立大黃魚魚卵魚露發酵過程中不同時間段的代謝產物的分析方法，用于揭示大黃魚魚卵發酵過程中形成的差異代謝產物及其代謝通路。以P值不大于0.05且VIP值不小于1為篩選條件得到包括糖類、醇類、氨基酸、酯類、醛類等在內的46種差異代謝物。進一步對差異代謝物的代謝通路進行分析，發現纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成，蛋白質消化吸收，半乳糖代謝，氨酰-tRNA生物合成，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，硫代葡萄糖苷生物合成，三羧酸循環，氨基酸的生物合成，莽草酸類生物堿的生物合成，磷酸肌醇代謝，不飽和脂肪酸的生物合成等11 條關鍵代謝通路，并且發現影響代謝通路的15種極顯著差異的代謝物種氨基酸類代謝物參與了多條代謝通路。本方法的建立和代謝產物的分析，為大黃魚魚卵魚露的工業化生產提供了理論支持，對于大黃魚魚卵魚露的發酵過程進行質量控制有重要意義。