飲用水中鹵代苯醌類消毒副產物樣品保存方法

李璐璐，王園媛，呂 佳，張 嵐

(中國疾病預防控制中心環境與健康相關產品安全所，中國疾病預防控制中心環境與人群健康重點實驗室，北京 100050)

飲用水消毒作為公共衛生領域最偉大的成就之一，在殺滅水中病原微生物以及預防介水傳染病暴發等方面發揮著重要作用。然而在消毒的同時，消毒劑會與水中的有機物和無機物(如碘化物、溴化物等)發生化學反應，產生消毒副產物(disinfection by-products，DBPs)，部分DBPs會對人體健康產生危害[1]。從1974年首次在飲用水中發現三氯甲烷開始，已經在飲用水中鑒別出1 000多種DBPs[2]。鹵代苯醌(halobenzoquinones，HBQs)是2010年新檢出的一類未受控DBPs，在美國[3]、加拿大[4]、中國[5]、日本[6]等地水廠均有檢出，檢出質量濃度在ng/L水平，其中2,6-二氯-1,4-苯醌的質量濃度最高可達到274.5 ng/L[4]。同樣，研究者們在游泳池水中也檢測到HBQs[7]。有研究通過結構-活性關系分析預測HBQs可能為導致膀胱癌、結直腸癌的致癌物[8]，進一步研究發現HBQs在代謝過程中可產生自由基[9]，包括活性氧(ROS)和羥基自由基以及DNA加合物[10]，其致癌性比受控的三鹵甲烷(trihalomethanes，THMs)和鹵乙酸(haloacetic acids，HAAs)強1 000倍[11]。另有研究[12]表明其細胞毒性和基因毒性也遠大于THMs和HAAs，引起了人們的廣泛關注。HBQs在水中不穩定，會發生水解反應[4]。但有研究[6]指出在飲用水管網中有余氯存在的情況下，前體物與余氯可持續生成DBPs。為了探究HBQs的真實暴露水平，了解HBQs的暴露對人體造成的潛在健康風險，需了解HBQs在水中的真實濃度。

為體現樣品中該物質的真實濃度，很有必要對HBQs的穩定性開展研究。本研究選取受研究者關注的12種HBQs，采用固相萃取-超高效液相色譜串聯質譜法對其進行定性和定量分析，探索其在實際樣品中的最佳保存條件，為檢測水樣中HBQs提供理論指導，為HBQs定性定量結果的準確性和可靠性提供重要保障。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器：超高效液相色譜-串聯質譜聯用儀(AB SCIEX公司，QTRAP 5500)，配有電噴霧電離源(electrospray ionization，ESI)；渦流振蕩器(美國Talboys公司，EOFO-945601)；電子天平(梅特勒托利多公司，ME104)；純水機(美國Millipore公司，Milli-Q Integral)；便攜式pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司，PHBJ-260)；超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司，SB-3200DTD)；余氯檢測儀(深圳清時捷科技有限公司，QCL-501)。

試劑與耗材：甲醇(MS級，美國Merck公司)；甲酸(HPLC-MS級，美國Fisher公司)；硫代硫酸鈉·五水合物(99.0%，上海麥克林生化科技有限公司)；抗壞血酸(99.0%，上海麥克林生化科技有限公司)；試驗用水為超純水(電阻率為18.2 MΩ·cm)；一次性針頭式過濾器(親水性PTFE膜，0.22 μm/13 mm，美國PALL公司)；液相色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm × 100 mm，1.8 μm，美國Waters公司)。

標準物質：2,5-二氯-1,4-苯醌(2,5-dichloro-1,4-benzoquinone，2,5-DCBQ)、3,4,5,6-四氯-1,2-苯醌(3,4,5,6-tetrachloro-1,2-benzoquinone，TetraC-1,2-BQ)、3,4,5,6-四溴-1,2-苯醌(3,4,5,6-tetrabromo-1,2-benzoquinone，TetraB-1,2-BQ)、2,3-二溴-5,6-二甲基-1,4-苯醌(2,3-dibromo-5,6-dimethyl-1,4-benzoquinone，DBDMBQ)、2,3,5,6-四溴-1,4-苯醌(2,3,5,6-tetrabromo-1,4-benzoquinone，TetraBBQ)購于美國Sigma公司。2,6-二氯-1,4-苯醌(2,6-dichloro-1,4-benzoquinone，2,6-DCBQ)、2,5-二溴-1,4-苯醌(2,5-dibromo-1,4-benzoquinone，2,5-DBBQ)購于美國AccuStandard公司。2,3,6-三氯-1,4-苯醌(2,3,6-trichloro-1,4-benzoquinone，TriCBQ)、2,6-二氯-3-甲基-1,4-苯醌(2,6-dichloro-3-methy-1,4-benzoquinone，DCMBQ)、2,6-二碘-1,4-苯醌(2,6-diiodo-1,4-benzoquinone，2,6-DIBQ)購于上海艾康睿醫藥科技有限公司。2,6-二溴-1,4-苯醌(2,6-dibromo-1,4-benzoquinone，2,6-DBBQ)購于加拿大TRC公司。2,3,5,6-四氯-1,4-苯醌(2,3,5,6-tetrachloro-1,4-benzoquinone，TetraCBQ)購于德國Dr.Ehenstor-fer公司。12種HBQs標準物質詳細信息如表1所示。

表1 12種HBQs標準物質信息Tab.1 Information of the 12 kinds of HBQs Standard Substances

1.2 試驗方法

根據試驗目的設置3個不同變量，分別為通用保存溫度(常溫、4 ℃)、常見采樣容器材質(棕色玻璃容器、棕色聚丙烯容器)和常用保存劑(抗壞血酸溶液、甲酸溶液、硫代硫酸鈉溶液)，評價各變量對測定結果在5 d內的影響程度，使用超高效液相色譜-串聯質譜法進行檢測并用峰面積定量。

1.2.1 混合標準物質溶液配制

分別稱取適量標準物質，用甲醇溶解后配置成質量濃度為100 mg/L的標準物質溶液。準確移取各標準物質溶液100 μL，用甲醇將其定容至1 mL，混勻，得到質量濃度為10 mg/L的混合標準物質溶液，于4 ℃冰箱內保存待用。

1.2.2 保存劑對水樣中HBQs的影響

準備4份40 mL飲用水樣品，3份分別加入0.3 mg抗壞血酸、0.3 mg硫代硫酸鈉和100 μL甲酸，以確保完全去除水樣中的游離性余氯，1份不加入保存劑作為對照。4份水樣均加入10 mg/L的混合標準物質溶液80 μL，混勻，于4 ℃儲存，每隔24 h取500 μL經0.22 μm濾膜過濾后上機測定。

1.2.3 采樣容器和保存溫度對水樣中HBQs的影響

準備4份10 mL飲用水樣品，分別加入25 μL甲酸和20 μL混合標準物質溶液，混勻。2份儲存于棕色聚丙烯塑料容器，分別放置在20 ℃和4 ℃溫度下；2份儲存于棕色硼硅酸鹽玻璃容器，分別放置在20 ℃和4 ℃溫度下。每隔24 h取500 μL經0.22 μm濾膜過濾后上機測定。

1.3 檢測方法

1.3.1 液相色譜條件

使用ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm，美國Waters公司)進行分離，柱溫設置為40 ℃。流動相A：0.1%甲酸-水溶液，流動相B：甲醇。流動相的流速為0.35 mL/min。進樣體積為10 μL。樣品室溫度控制在15 ℃。梯度洗脫程序如表2所示。

1.3.2 質譜條件

本試驗采用超高效液相色譜-串聯質譜聯用儀(AB SCIEX公司QTRAP 5500)。使用ESI進行離子化；使用負離子模式掃描；檢測方式為多反應監測掃描模式(MRM)。離子源溫度設置為700 ℃。其他質譜參數條件設置如下：氣簾氣(CUR)壓力為22 psi(1 psi=6.895 kPa)；離子化電壓(IS)為-4 500 V；噴霧氣(GS1)壓力為55 psi；輔助加熱氣(GS2)壓力為65 psi；碰撞氣(CAD)為Medium。12種HBQs的定量定性離子、去簇電壓(DP)和碰撞電壓(CE)如表3所示。

表2 梯度洗脫程序條件Tab.2 Conditions of Gradient Elution Procedure

表3 12種HBQs的定量定性離子、DP和CETab.3 Quantitative Qualitative Ions,DP,and CE for the 12 kinds of HBQs

1.4 HBQs的穩定性評價

連續測定樣品中目標分析物在第0、1、2、3、4、5 d的峰面積，按式(1)計算回收率以評估HBQs的穩定性，對各個目標分析物的峰面積進行連續監測。每個樣品重復測量3次取平均值。運用Excel軟件對數據進行整理分析。

R=ADi/AD0

(1)

其中：R——回收率；

AD0——目標分析物在第0 d的峰面積；

ADi——為目標分析物在第id的峰面積(i=1、2、3、4、5)。

2 結果和討論

2.1 方法線性關系、檢出限和定量限

用飲用水作為基質稀釋混合標準物質溶液配制標準系列，2,6-DCBQ、2,6-DBBQ、2,5-DBBQ、DCMBQ、TetraCBQ、TetraB-1,2-BQ、TetraBBQ的標準系列質量濃度為0.1、0.5、2.0、5.0、10.0、50.0 μg/L；TriCBQ的標準系列質量濃度為0.5、2.0、5.0、10.0、50.0、100.0 μg/L；2,5-DCBQ的標準系列質量濃度為1、2、5、10、50、100 μg/L系列混合標準溶液；DBDMBQ的標準系列質量濃度為4、8、20、40、100 μg/L系列混合標準溶液；2,6-DIBQ、TetraC-1,2-BQ的標準系列質量濃度為0.02、0.04、0.20、0.40、1.00 μg/L系列混合標準溶液。以目標分析物質量濃度為橫坐標，相應峰面積為縱坐標，繪制工作曲線，結果顯示，12種化合物在各標準系列濃度范圍內均呈良好線性關系，相關系數均大于0.99。以目標分析物色譜峰信噪比S/N=3、S/N=10分別計算對應的質量濃度作為檢出限和定量限。12種HBQs的檢出限和定量限如表4所示。

2.2 穩定性結果分析

2.2.1 保存劑對水樣中的HBQs穩定性的影響

在水樣中加入保存劑可以阻止前體物與消毒劑繼續反應，確保DBPs含量的真實性。有研究[13]表明水樣中是否加入保存劑對DBPs檢出濃度有顯著性影響。本研究對比了在添加抗壞血酸、硫代硫酸鈉、甲酸后的水樣中HBQs的穩定性，同時還在不含保存劑的水樣中進行了對照試驗，結果如圖1所示。在不加保存劑的水樣中，除TetraC-1,2-BQ、TetraB-1,2-BQ和DBDMBQ外，其余物質在24 h內均降解到檢出限以下，所有物質在5 d內均不能穩定存在。

表4 12種HBQs的檢出限和定量限Tab.4 Limits of Detection and Limits of Quantification for 12 Types of HBQs

有研究[14]發現，飲用水中存在2,6-DCBQ、2,6-DBBQ、DCMBQ和TriCBQ向其水解產物——羥基類似物的轉化過程。在添加了硫代硫酸鈉的水樣中，除TetraC-1,2-BQ和TetraB-1,2-BQ外，其余物質在24 h內均降解到檢出限以下。對水樣添加保存劑前后的pH進行檢測(表5)，發現加入硫代硫酸鈉后水樣的pH升高，這可能與HBQs在堿性條件下易水解有關[15]。TetraC-1,2-BQ和TetraB-1,2-BQ可在硫代硫酸鈉溶液中穩定3 d，可能是其與硫代硫酸鈉形成加合物[16]。雖然抗壞血酸和甲酸都能夠提供酸性環境，但與甲酸相比，抗壞血酸中TriCBQ、TBBQ、TCBQ、2,6-DBCMBQ、TetraB-1,2-BQ和DCMBQ第5 d的回收率均低于85%，均低于甲酸。綜上所述，在水樣中添加甲酸可以使HBQs在5 d內保持穩定。

圖1 各物質在保存劑中的穩定性(回收率)Fig.1 Stability of Each Halobenzoquinones in Water with Preservation (Recovery)

2.2.2 采樣容器和保存溫度對水樣中HBQs穩定性的影響

由于HBQs具有光敏性[17]，本文選取不同材質的棕色采樣瓶以探究其對HBQs穩定性的影響。如圖2所示，在常溫和4 ℃條件下，棕色硼硅酸鹽玻璃容器中12種HBQs的穩定性均優于棕色聚丙烯容器，其中TC-1，2-BQ、TBBQ、TetraB-1,2-BQ在4 ℃條件下的聚丙烯容器中第5 d回收率均低于50%。因此，玻璃材質的棕色采樣瓶更適合作為采集和保存水樣的容器。HBQs的穩定性受溫度影響較為明顯。玻璃材質中，在4 ℃條件下各種物質的測定值隨時間變化穩定于96%～103%，而在常溫條件下5 d內呈下降趨勢，其中2,6-DBBQ下降較為明顯，在常溫時回收率隨時間逐漸降低至54%。綜上，水樣在4 ℃棕色玻璃瓶中可穩定保存。

圖2 各物質在不同保存容器中的穩定性(回收率)Fig.2 Stability of Each Halobenzoquinones in Different Storage Containers (Recovery)

表5 飲用水中添加抗壞血酸、硫代硫酸鈉、甲酸前后游離性余氯和pH值的變化Tab.5 Changes in Free Residual Chlorine and pH Value Before and After Addition of Ascorbic Acid,Sodium Thiosulfate and Formic Acid to Drinking Water

3 結論

本試驗以12種HBQs作為研究對象，使用超高效液相色譜-串聯質譜法對水樣中HBQs的穩定性進行檢測。研究發現在樣品中添加甲酸，既能去除余氯維持HBQs的穩定性，又能調節溶液pH。對比棕色玻璃容器和棕色塑料容器，發現HBQs在前者中更穩定；研究發現HBQs在4 ℃條件比在常溫條件下穩定性更好。因此，在采集水樣時應使用棕色玻璃容器，采集后應立即加入甲酸，并在低溫冷藏條件下運輸，5 d內檢測以確保檢測結果的準確性。本試驗探索了水樣中HBQs的最佳保存條件，有利于探究HBQs在環境中的濃度水平，為HBQs定性定量結果的準確性和可靠性提供重要保障，也為客觀、真實地反映水樣中HBQs濃度限值提供理論指導。