血漿miR-204在冠心病患者中的表達及其臨床意義

李斯 尹明潔 米穎 孫雅楠

【摘要】? 目的? 檢測冠心病（CHD）患者血漿中miR-204的表達水平，評估血漿miR-204對于CHD的診斷價值。方法? 首先選取2018年1月- 2020年1月醫院就診的CHD患者30例為CHD組，健康人員28例為對照組。應用實時熒光定量PCR方法，檢測miR-204因子在兩組血漿中的表達水平；其次應用受試者工作特征曲線（ROC），進一步分析血漿miR-204對于CHD的診斷價值。結果? CHD組患者血漿miR-204的水平顯著低于對照組，組間差異有統計學意義（P<0.05）；血漿miR-204用于診斷CHD的ROC曲線下面積（AUC）=0.717（95%CI：0.575～0.858）。當臨界值為0.00075；血漿miR-204診斷CHD靈敏度=53.333%，特異度=100.000%，Kappa=0.523。診斷結果與實際結果中高度一致，具有臨床應用價值，但漏診率較高。結論? CHD患者血漿miR-204的表達水平顯著降低，當血漿miR-204>0.00075診斷CHD時，具有一定臨床參考價值，但需注意漏診率偏高。

【關鍵詞】? miR-204；冠心病；實時熒光定量PCR；受試者工作特征曲線

中圖分類號? R541.4? ? 文獻標識碼? A? ? 文章編號? 1671-0223（2023）03--03

microRNA（miRNA）具有調節生長發育、調整機體生理病理狀態的微小RNA。miRNA在正常狀態下，穩定的存在于人體的循環系統及組織細胞中[1-2]。miR-204是miRNA家族成員之一，目前研究表明其在心血管系統中表達，發揮調節血管細胞功能的作用[3]。冠心病（CHD）患者由于血管管腔狹窄往往會引發一系列臨床癥狀，其血漿miR-204表達水平是否會發生變化尚未見報道。本研究通過與健康人對比，分析CHD患者血漿miR-204表達水平，旨在探討血漿miR-204在CHD疾病中的變化以及用于CHD無創診斷的可能性。

1? 對象與方法

1.1? 研究對象

選取2018年1月- 2020年1月醫院就診的CHD患者30例為CHD組（病例組）。納入標準：符合2011《美國心臟學會及美國心臟病學會不穩定型心絞痛/非ST段抬高心肌梗死指南》診斷標準，并且冠狀動脈造影結果提示冠狀動脈血管直徑狹窄程度≥50%的血管至少1支。排除標準：先天性心臟病患者、心臟瓣膜受累型疾病患者、嚴重的充血性心力衰竭患者；患者伴有肝臟、腎臟、免疫性的疾病，以及惡性腫瘤性疾病、血栓性疾病，以及出血性的疾病等；近期伴有各種急慢性的炎癥疾病患者或者是大型創傷性損傷血管的疾病等情況。同期選擇年齡、性別等與病例組相匹配的健康人員28例為對照組。本研究由醫院倫理委員會批準通過，所有研究對象均簽署了知情同意書。

1.2? 實驗室檢測方法

（1）標本的采集：早8點冠狀動脈造影之前，空腹行肘靜脈采血收集血標本。

（2）血漿中總RNA的提取：本研究使用mirVana Paris Kit反應試劑盒，根據說明書逐步提取標本血漿中的總RNA，實驗后標本放置于-80℃的冰箱凍存保留。

（3）cDNA的合成：應用實時熒光定量PCR（Taqman探針法），首先配置RT-PCR的反應體系，其中10×buffer是0.8μl、RNA 4.5μl、dNTP 0.2μl、抑制劑為 0.1μl、無水的RNase 0.4μl、RNA 引物 為1.5μl、RTase 0.5μl，總反應體系為8μl充分搖勻，全過程需在冰浴上操作。反應條件設置為：16℃60 min、42℃60 min、85℃5 min、4℃下保持循環。

（4）RT-PCR 配置：反應體系為：2×TaqMAN universal PCR Master MIX為10μl、無水RNase 5μl、TaqMAN 探針 1μl、cDNA為 4μl，總反應體系為20μl，設定的反應條件為：首先起始模板預變性95℃10 分鐘，中模板變性95℃15 秒、60℃60秒進行退火的循環共40次；每個實驗的樣本均做一個副管，每個實驗重復3次，記錄每次實驗的CT值，取平均值，后期經2-?CT轉換。

1.3? 統計學方法

采用SPSS 17.0以及GraphPAD Prism 5.0 統計軟件對數據進行分析及作圖。計數資料計算百分率，兩組間率比較采用卡方檢驗；正態分布的計量資料使用“±s”表示，兩組間均數比較采用獨立樣本t檢驗；非正態分布的計量資料用“M（P25，P75）”來表示，兩組間中位數比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗。雙側檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2? 結果

2.1? 兩組研究對象基本特征比較

病例組與對照組之間性別、年齡、空腹血糖、膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平比較，差異均無統計學意義（P>0.05），見表1。

2.2? 兩組血漿miR-204的表達水平比較

對照組血漿miR-204表達水平明顯高于病例組，差異有統計學意義（P<0.05），見表2，表明CHD患者血漿miR-204表達水平顯著降低。

2.3? 血漿miR-204水平用于CHD診斷的效能

ROC分析結果顯示，血漿miR-204水平用于CHD診斷的AUC=0.717（95%CI：0.575～0.858），說明血漿miR-204具有一定的CHD診斷效能，見圖1。根據約登指數最大原則，篩選出血漿miR-204診斷CHD的臨界值為0.00075（2-?CT轉換后）。

2.4? 血漿miR-204用于CHD的診斷結果

以血漿miR-204表達水平（2-?CT轉換后）

3? 討論

miRNA是一類廣泛存在人體各組織細胞及循環系統中的非編碼小RNA ， miRNA的存在具有相對較高的穩定性，如在反復凍融過程中（4～-80℃）、血漿酸堿度水平的變化以及裂解酶存在的條件下，研究證實其不易被降解破壞，報道證實其能夠比較穩定地存在[4]。miRNA的研究領域之前在衡量miRNA重要性的研究，目前發展到專注于特定miRNA子集的研究，包括這些特定miRNA對于系統穩定和病理生理條件的有效調節因子，以上特點使血漿miRNA研究逐步精細化及標準化。

miR-204是miRNA家族成員之一，我們前期回顧了其分子特征和調節作用，證據表明miR-204在調節心血管生理學和病理生理過程中發揮重要作用，并且miR-204表現出高度組織特異性的表達模式，受多種轉錄和轉錄后機制的調控[5]。有研究證實miR-204在減輕肺動脈高壓和高血壓中的作用，同時在廣泛的模型系統中促進高血壓和內皮功能障礙。miR-204可能通過以組織特異性的方式靶向幾種生物途徑來影響這些疾病過程[6]。miR-204在心血管和腎臟疾病中是一種高價值的miRNA。

冠心病即為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病，據統計發現當今世界CHD的發病率與死亡率在發達及發展中國家已經超過腫瘤性疾病、傳染性疾病等，成為成人首要的死亡原因之一[7]。CHD的患者極易發展為不穩定型心絞痛、慢性穩定型心絞痛及急性心肌梗死等嚴重疾病，病死率極高，加重家庭負擔及社會醫療資源的極大負擔，嚴重影響人類的生存質量[8]。對于CHD患者早期識別早期診斷是當今醫師面臨的社會責任，做好CHD的預防與早期識別有助于患者早期就診，早期治療，預防重癥疾病的發生。

CHD早期識別的血漿血因子研究較多，miRNA在CHD的研究也有報道，表明在CHD發病所相關血管管腔狹窄及炎癥反應過程中，血漿中多種miRNA的表達水平相較于正常狀態會發生波動，并且研究進一步證實，表達水平的變化與冠狀動脈病變的嚴重程度可能具有一定關系。目前研究表明miR-204具有抑制心肌損傷的作用，其機制可能是直接抑制炎癥因子白介素的表達[9]。還有學者研究miR-204在頸動脈粥樣硬化患者血漿中的表達，并對其作用機制研究表明，其可能抑制ox-LDL誘導的巨噬細胞膽固醇積累和凋亡發揮抑制動脈硬化的作用[10]。在人類受試者和嚙齒類動物中研究表明miR-204表達水平是肺動脈高壓發生的生物標志物，并且與肺動脈高壓的嚴重程度相關[11-12]。最近，有學者[13]的研究顯示，在肺動脈高壓患者外周血細胞中miR-204在肺血管血液循環系統和細胞內表達顯著減少。在1型糖尿病研究中發現循環miR-204水平也發生顯著變化。其可能在細胞外液中的細胞間信號傳導及蛋白表達調節發揮作用。對于miR-204在冠心病患者血漿中的表達水平研究顯示，CHD組患者血漿miR-204水平顯著低于對照組，并且通過ROC曲線分析表明miR-204對于CHD的診斷價值曲線下面積（AUC）= 0.717（95%CI：0.575～0.858，P<0.05）臨界值為0.00075；血漿miR-204診斷CHD靈敏度53.333%，特異度100.000%，Kappa值為0.523，表明診斷結果與實際結果具有中高度一致性，具有臨床應用價值，但漏診率過高。

4? 參考文獻

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[2022-12-16收稿]