益腎通癃湯對前列腺癌裸鼠模型Nrf－2、SOD1的影響

林夢姣，劉德果，趙姣，蘇藝峰，向時竹，陳其華

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是威脅男性身心健康的惡性腫瘤，隨著生活方式的轉變，我國PCa 患者發病率正逐步提高，并呈現老年多于青中年、城市多于農村的發病特點［1］。PCa 出現臨床癥狀時多數已達到晚期，預后較差。雄激素剝奪治療是目前公認的晚期PCa 治法，但因其有效期短、副作用多、易耐藥性等不足，臨床難以取得較好的療效［2?3］。

益腎通癃湯是湖南中醫藥大學第一附屬醫院陳其華教授經驗方，近20 年的臨床應用表明其能有效緩解PCa 患者臨床癥狀，團隊相關實驗表明其能降低炎性指標水平，減輕化療藥物毒副作用［4］，但其具體機制仍需進一步證實。

現代研究表明，氧化應激與PCa 的發生和發展息息相關，參與PCa進程［5］。基于PCa細胞大量增殖及侵襲的特點，其生命活動需要一定量的活性氧（ROS）維持，當大量的ROS 蓄積在胞漿中，誘導產生嚴重的氧化應激反應［6］，便可通過細胞凋亡［7?8］、上皮－間質轉化［9］、雄激素受體信號再激活等途徑造成癌細胞凋亡［10?11］。而核因子紅細胞2相關因子2（Nrf－2）和超氧化物歧化酶1（SOD1）作為兩種主要的保護因子參與其中。PCa 細胞可通過兩種因子的釋放降低氧化應激反應，從而減少凋亡的發生。

本研究旨在探討益腎通癃湯產生臨床療效的機制，觀察其是否與通過下調Nrf－2、SOD1 的表達以誘導PCa細胞產生高度氧化應激反應有關。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞株

PC－3 細胞株購自中國科學院細胞庫，在湖南中醫藥大學中醫診斷湖南省重點實驗室長期凍存。

1.1.2 實驗動物

SPF 級雄性BALB/c 裸鼠40 只，體質量20～22 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產許可證號：SCXK（湘）2019－0004，動物使用許可證號：SYXK（湘）2019－0009。飼養于湖南中醫藥大學醫學創新實驗中心SPF 動物房，飼以SPF 級顆粒飼料并自由飲水，動物房自然采光，相對濕度為50%～75%，溫度為22～24 ℃。本實驗已通過倫理審查，倫理批號：

LBH－20201011000。

1.1.3 實驗藥物

益腎通癃湯組方：補骨脂15 g，熟地黃15 g，黃芪30 g，三棱10 g 和莪術10 g；均購于湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房，加適量蒸餾水兩次煎煮共50 min，將藥液濃縮至每1 mL 藥液含生藥量1.44 g。其中益腎通癃湯中劑量組為益腎通癃湯原方劑量折算后劑量（相當于成人等效劑量，即每1 mL 藥液含生藥量1.44 g），益腎通癃湯高劑量組相當于成人等效劑量的2 倍，益腎通癃湯低劑量組相當于成人等效劑量0.5倍。

1.1.4 主要試劑與設備

F12/DMEM 1∶1 培養基、胎牛血清、PBS（Hyclone 公司）；胰蛋白酶（南京吉諾環境科技有限公司）；ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；Trizol（美國Thermo）；mRNA 逆轉錄試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）；EDTA（中國大連美倫生物技術有限公司）；Nrf－2、SOD1 抗體及相應二抗（美國proteintech）；DYY－6C 恒溫箱（北京六一生物科技有限公司）；BA210T顯微鏡（Motic）；PIKOREAL96熒光定量RCP儀（美國Thermo）；DYY－2C電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及PCa裸鼠模型建立

制備前列腺癌PC－3 細胞懸液，使其密度為1 × 106/mL，BALB/c 裸鼠腹股溝消毒，并在消毒部位接種0.1 mL 上述細胞混合液，1 周后部分裸鼠可觸及粟粒樣大小的瘤體，接種2 周后，裸鼠皮下可見長徑約3 mm 的瘤體，即為動物腫瘤模型建立成功，40 只裸鼠均造模成功。

1.2.2 動物分組及給藥

造模成功后，將40 只裸鼠隨機分成4 組，分別為模型組，益腎通癃湯低、中、高劑量組（以下簡稱低、中、高劑量組），每組10 只。模型組灌胃生理鹽水［1 mL/（100 g·d）］，益腎通癃湯各劑量組分別灌胃0.72、1.44、2.88 g/mL生藥量的益腎通癃湯［1 mL/（100 g·d）］，給藥時間21 d。末次給藥后12 h，摘取眼球取血，脫頸處死裸鼠，完整剝離瘤體，稱取瘤重，并計算抑瘤率。

抑瘤率（%）=（1－實驗組平均瘤重/模型組平均瘤重）× 100%

1.3 檢測方法

1.3.1 HE染色觀察腫瘤組織病理改變

經過烤片、切片脫蠟、蘇木素染1～5 min、伊紅染色1 s、脫水、樹膠封片等步驟得到成片，鏡下觀察并拍照。

1.3.2 ELISA檢測Nrf－2、SOD1含量

取4 組裸鼠血液離心制備血清，嚴格按ELISA 試劑盒說明書進行操作，檢測Nrf－2、SOD1含量。

1.3.3 Western blot法檢測Nrf－2、SOD1蛋白表達

提取組織蛋白，離心后取上清煮沸后速冷。經過電泳、上樣、轉膜后添加Nrf－2、SOD1抗體，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育90 min顯影沖洗。將曝光后的底片掃描，并用Quantity one專業灰度分析軟件進行分析。

1.3.4 RT－PCR檢測Nrf－2、SOD1 mRNA表達

各取4 組小鼠各25 mg 瘤體組織，使用Trizol 裂解樣品，提取細胞總RNA，逆轉錄cDNA，采用SYBR 法進行PCR 擴增，PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統觀察，引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.4 統計學方法

本研究采用SPSS 25.0 統計軟件進行數據統計學分析。計量資料以±s表示，組間比較采用方差分析。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組裸鼠抑瘤率比較

結果顯示，各組抑瘤率具有顯著差異，且抑瘤率隨藥物濃度的上升而增高，呈劑量依賴性。見表2。

表2 各組抑瘤率比較

2.2 HE染色觀察瘤體病理改變

模型組中可見大量PCa 細胞核分裂象，而益腎通癃湯高劑量組中可見細胞核裂解，裂解程度高劑量組明顯大于低、中劑量組，但低、中劑量組較模型組細胞核裂解象未見明顯差異。見圖1。

圖1 各組瘤體組織病理變化（HE，× 100）

2.3 移植瘤中Nrf－2、SOD1含量比較

ELISA 結果顯示，與模型組比較，益腎通癃湯低、中、高劑量組可降低PCa裸鼠瘤體組織中Nrf－2、SOD1的含量（P＜ 0.01），并呈劑量依賴性，即藥物濃度越高，Nrf－2、SOD1含量越低。見表3。

表3 各組瘤體中Nrf－2、SOD1含量比較（±s）

表3 各組瘤體中Nrf－2、SOD1含量比較（±s）

注：與模型組比較，aP ＜ 0.01；與低劑量組比較，bP ＜ 0.01；與中劑量組比較，cP ＜ 0.01。

2.4 移植瘤中Nrf－2、SOD1蛋白表達

Western blot 結果顯示，與模型組比較，益腎通癃湯干預能降低移植瘤中Nrf－2、SOD1 蛋白的表達（P＜ 0.01），并隨著濃度升高，降低幅度增大，見表4和圖2。

圖2 各組Western blot印跡結果

表4 各組瘤體中Nrf－2、SOD1蛋白表達比較（±s）

表4 各組瘤體中Nrf－2、SOD1蛋白表達比較（±s）

注：與模型組比較，aP ＜ 0.01；與低劑量組比較，bP ＜ 0.01；與中劑量組比較，cP ＜ 0.01。

2.5 移植瘤中Nrf－2、SOD1 mRNA的表達

RT－PCR 結果顯示，與模型組比較，益腎通癃湯低、中、高劑量組PCa 裸鼠瘤體組織中Nrf－2、SOD1 mRNA 表達顯著下調（P＜ 0.01），且藥物濃度越高，下調幅度越大。見表5。

表5 各組瘤體中Nrf－2、SOD1 mRNA的表達比較（±s）

表5 各組瘤體中Nrf－2、SOD1 mRNA的表達比較（±s）

注：與模型組比較，aP ＜ 0.01；與低劑量組比較，bP ＜ 0.01；與中劑量組比較，cP ＜ 0.05，dP ＜ 0.01。

3 討論

本課題組前期研究發現，益腎通癃湯能夠有效抑制前列腺組織微血管生成及血清中雌/雄激素的比例失衡，調節COX－2及PGE－2表達，降低炎性反應程度［12］，影響HIF－1α 的表達有效抑制新生血管形成［13］。本研究發現，其能夠明顯抑制PCa瘤體的生長，且抑瘤率隨藥物濃度的上升而增強；鏡下觀察HE染色顯示，益腎通癃湯干預能夠促進PCa細胞核裂解，引起細胞凋亡。

在荷瘤狀態下，Nrf－2 作為腫瘤細胞的保護因子被釋放，通過Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1（Keap1）－核因子紅細胞2 相關因子2（Nrf－2）/抗氧化反應元件（ARE）通路減輕氧化應激對腫瘤細胞的有害反應，并可對化療藥物起到增毒減效的效果［14］。氧化應激產生的氧自由基不能被腫瘤細胞清除，SOD1可將氧自由基歧化為H2O2，再進一步被機體清除［15］，達到抗氧化的目的，延緩癌細胞凋亡，最終導致疾病進展。本實驗中PCR、ELISA、Western blot 結果均顯示，益腎通癃湯干預可明顯下調Nrf－2 及SOD1 表達，說明益腎通癃湯可能是通過抑制Nrf－2、SOD1 的表達，誘導癌細胞氧化應激反應，促進腫瘤細胞凋亡，減小腫瘤體積，從而達到對PCa的治療作用。

益腎通癃湯組方中補骨脂、熟地黃、黃芪、三棱和莪術，其單體藥物已被現代諸多研究證實有效成分具有抗腫瘤的活性［16?20］，且有效活性成分不止一種，但均以中藥單體為主進行實驗研究。中藥配伍是中醫辨證論治的一大特色，通過配伍使藥物減毒增效是根本目的，在單體實驗中有效的活性成分經過配伍之后是否具有相同的抗癌活性甚至更高是現代中藥復方研究的熱點與難點。本研究目前的實驗設計僅能證實益腎通窿湯可通過下調Nrf－2、SOD1表達達到治療PCa的目的，但此中藥復方中主要抗癌活性成分、活性與劑量相關關系、五味中藥的配伍是否使抗癌效果最大化等問題尚不明確，仍需要團隊進一步實驗證實，為臨床指導用藥提供理論依據。

綜上所述，益腎通癃湯可有效治療PCa，其機制可能與下調Nrf－2、SOD1 的表達有關，但其有效成分需進一步研究證實。