紫蘇葉多糖的提取工藝優(yōu)化及理化特性分析

丁素蕓，閆芝茜，劉會(huì)平，張曉維，陳沛，鞏婷婷，司凱

（天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457）

紫蘇葉為一年生草本植物紫蘇的葉片，屬被子植物亞門、雙子葉植物綱、唇形科、紫蘇屬，紫蘇的別名有很多，例如紅蘇、香蘇等[1-2]。紫蘇在我國(guó)是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，應(yīng)用范圍廣，在我國(guó)北方地區(qū)主要用來榨油，兼做藥用；而南方地區(qū)主要用于醫(yī)藥方向，兼做香料或食用[3]。2002年紫蘇被國(guó)家中醫(yī)藥管理局列入既可食用又可作為藥用的物品名單，成為首批“藥食同源”植物之一，可用作天然香料、化工原料、食品和藥品原料等，在工業(yè)、醫(yī)藥、保健等方面均有較大的研究?jī)r(jià)值[4-5]。

紫蘇葉中含有蛋白質(zhì)、氨基酸以及微量元素等豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。《中國(guó)藥典》[6]中記載，紫蘇葉具有解表散寒、行氣和胃的功效，可以用來發(fā)汗、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳等。中醫(yī)認(rèn)為紫蘇葉能夠緩解支氣管痙攣、擴(kuò)張皮膚血管、促進(jìn)消化液的分泌等，具有解魚蟹毒、祛暑、降血壓的作用，還可以對(duì)動(dòng)脈硬化、痢疾、消化不良等夏秋季節(jié)易發(fā)的疾病起到預(yù)防作用[7]。現(xiàn)代藥理的眾多研究表明，紫蘇葉中含有揮發(fā)油類[8]、黃酮類[9]、花青素[10]、酚酸類[11]、多糖類[12]等多種生物活性成分，具有抗氧化[13]、抗腫瘤[14]、降血糖[15]、抗炎抗菌[16]等多種藥理功能。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)紫蘇葉的研究主要集中在種植技術(shù)[17]、化學(xué)成分分析[18-19]、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及藥用成分分析[20-22]等方面，而對(duì)紫蘇葉多糖的提取分離、理化特性等方面的研究還有待深入。本試驗(yàn)以紫蘇葉為原料，通過單因素試驗(yàn)探究料液比、提取時(shí)間以及醇沉濃度對(duì)紫蘇葉多糖得率的影響，再利用響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝條件，并對(duì)紫蘇葉多糖的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，以期為紫蘇葉資源的開發(fā)利用以及深加工途徑提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇葉：安徽省六安市大別山；無水乙醇、正丁醇、三氯甲烷：江天化工技術(shù)股份有限公司；100 kDa透析袋、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品：北京索萊寶科技有限公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DZF-6020）：上海傳訊實(shí)業(yè)有限公司；高速粉碎機(jī)（SE-750）：浙江永康市圣象電器有限公司；低速離心機(jī)（TDZ5-WS）：長(zhǎng)沙湘儀儀器有限公司；冷凍干燥機(jī)（FD-1C-50）：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52A）：上海亞榮生化儀器廠；掃描電子顯微鏡（SU1510）：日本日立公司；差示掃描量熱儀（60Plus）：日本島津公司；熱重分析儀（TGA-Q500）：美國(guó)TA 公司；X-射線衍射儀（Ultima IV X）：日本理學(xué)株式會(huì)社。

1.3 紫蘇葉多糖的提取分離及純化方法

紫蘇葉片在鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒重、粉碎機(jī)粉碎，過80目篩后得到紫蘇葉粉末原料。稱取適量干燥的紫蘇葉粉末，向其中加入一定比例的蒸餾水，置于100℃熱水中熱提 3 h，離心（4 000 r/min，15 min）過濾渣滓后，將3次提取后的紫蘇葉多糖上清液合并，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮至初體積的1/3，再根據(jù)濃縮后的體積加入無水乙醇，將混合溶液在4℃條件下醇沉過夜（12 h）后，4 000 r/min離心 15 min，收集離心后的底層多糖混合物沉淀，吹干沉淀中殘留的乙醇，蒸餾水復(fù)溶沉淀后于8 000 r/min離心10 min以去除混合物中的不溶性雜質(zhì)，最終收集上清液用冷凍干燥機(jī)在-80℃進(jìn)行冷凍干燥后得到紫蘇葉粗多糖。用Sevage法去除紫蘇葉粗多糖中的蛋白雜質(zhì)，利用100 kDa透析袋進(jìn)行透析、Sephadex G-200柱層析法對(duì)紫蘇葉粗多糖進(jìn)行純化，得到均一組分的紫蘇葉多糖，將其命名為PFP（Perilla frutescens var.frutescens polysaccharide）。多糖得率的計(jì)算公式如下。

多糖得率/%=M1/M2×100

式中：M1為紫蘇葉粗多糖質(zhì)量，g；M2為紫蘇葉粉末樣品質(zhì)量，g。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用苯酚-硫酸法[23]測(cè)定PFP中的總糖含量。準(zhǔn)確稱量葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水配制成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取6只干凈試管根據(jù)表1加入試劑，將試劑混勻后靜置10 min，然后30℃水浴20 min，反應(yīng)全部結(jié)束后于490 nm處測(cè)定吸光度，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，溶液配制見表1。

表1 溶液配制Table 1 Solution preparation

1.5 樣品中總糖含量的測(cè)定

用1.4中的方法進(jìn)行PFP的配制，把測(cè)得的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出PFP的總糖含量。

1.6 單因素試驗(yàn)

1.6.1 料液比對(duì)紫蘇葉多糖得率的影響

在5個(gè)燒杯中分別加入適量的紫蘇葉粉末，按照1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL）的料液比用蒸餾水溶解，在溫度為100℃條件下水提4 h，提取3次。結(jié)束后4 000 r/min離心15 min，收集上清液，加入上清液體積1.5倍的乙醇進(jìn)行醇沉12 h，8 000 r/min離心5 min、凍干后稱重，計(jì)算出不同料液比提取下的紫蘇葉多糖得率。

1.6.2 提取時(shí)間對(duì)紫蘇葉多糖得率的影響

在5個(gè)燒杯中分別加入適量的紫蘇葉粉末，按料液比1∶30（g/mL）加入蒸餾水溶解，在100℃下分別提取 1、2、3、4、5 h，提取 3 次。結(jié)束后 4 000 r/min 離心15 min，收集上清液，加入上清液體積1.5倍的乙醇進(jìn)行醇沉12 h，8 000 r/min離心5 min、凍干后稱重，計(jì)算出不同提取時(shí)間下的紫蘇葉多糖得率。

1.6.3 醇沉濃度對(duì)紫蘇葉多糖得率的影響

在5個(gè)燒杯中分別加入適量的紫蘇葉粉末，按料液比1∶30（g/mL）加入蒸餾水，在100℃下提取4 h，提取3次，結(jié)束后4 000 r/min離心15 min，收集濃縮3次提取后的紫蘇葉多糖上清液，向其中加入乙醇使最終濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%，8 000 r/min離心5 min、凍干后稱重，計(jì)算出不同醇沉濃度下的紫蘇葉多糖得率。

1.7 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝方法

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，使用Design-Expert 8.0軟件根據(jù)Box-Behnken原理設(shè)計(jì)試驗(yàn)?zāi)Ｐ停疾旄饕蛩貙?duì)紫蘇葉多糖得率的影響，確定紫蘇葉多糖的最佳提取條件。試驗(yàn)因素和水平見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素水平編碼Table 2 The factors and levels of response surface experiment design

1.8 理化特性分析

1.8.1 差示掃描量熱分析

稱取3 mg PFP樣品放入坩堝中，用壓片機(jī)壓緊后置于差示掃描量熱儀（differential scanning calorimetry，DSC）進(jìn)行熱特性檢測(cè)，溫度范圍25℃～200℃，升溫速率10℃/min。

1.8.2 熱穩(wěn)定性分析

稱取2 mg PFP樣品放入托盤中，需保證PFP全部放入樣品盤中，邊緣無外漏，利用熱重分析儀（thermo gravimetric analyzer，TGA）對(duì)PFP的熱穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)，溫度范圍25℃～600℃，升溫速度10℃/min，根據(jù)TGA曲線對(duì)PFP的熱解進(jìn)行分析。

1.8.3 X-射線衍射分析

取50 mg PFP樣品，將表面壓平后置于X-射線衍射儀（X-ray diffractometer，XRD）檢測(cè)板上進(jìn)行X射線掃描，掃描條件：2θ變化范圍 5°～90°，速度 2°/min。

1.9 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用Origin 2018進(jìn)行圖表的制作與處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)紫蘇葉多糖得率的影響

圖1為料液比對(duì)紫蘇葉多糖得率的影響。

圖1 料液比對(duì)紫蘇葉多糖得率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on yield of polysaccharides from Perilla frutescens var.frutescens

由圖1可知，紫蘇葉多糖得率隨著蒸餾水體積的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)料液比為1∶30（g/mL）時(shí)，紫蘇葉多糖得率達(dá)到最高，為（5.18±0.13）%，繼續(xù)增加蒸餾水的比例，多糖得率反而降低，這可能是因?yàn)槎嗵且酝獾钠渌镔|(zhì)溶出量變多，與多糖呈現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系從而導(dǎo)致多糖得率降低[8]。結(jié)果表明，當(dāng)料液比為1∶30（g/mL）時(shí)，紫蘇葉多糖溶出的最多，因此選擇1∶30（g/mL）的料液比進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)紫蘇葉多糖得率的影響

圖2為提取時(shí)間對(duì)紫蘇葉多糖得率的影響。

圖2 提取時(shí)間對(duì)紫蘇葉多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on yield of polysaccharides from Perilla frutescens var.frutescens

由圖2可知，隨著提取時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，多糖不斷溶出，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到4 h時(shí)，多糖得率達(dá)到（4.95±0.13）%。繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，多糖得率降低至（4.87±0.10）%，提取時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)紫蘇葉多糖的得率也有影響，當(dāng)提取時(shí)間太短，會(huì)導(dǎo)致提取過程不充分，因此多糖的得率較低，若時(shí)間過長(zhǎng)，溶質(zhì)會(huì)出現(xiàn)溶解平衡現(xiàn)象，得率便會(huì)維持基本不變[24]。因此選擇提取4 h進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.3 醇沉濃度對(duì)紫蘇葉多糖得率的影響

圖3為醇沉濃度對(duì)紫蘇葉多糖得率的影響。

圖3 醇沉濃度對(duì)紫蘇葉多糖得率的影響Fig.3 Effect of alcohol precipitation on yield of polysaccharides from Perilla frutescens var.frutescens

從圖3可以看出，醇沉濃度對(duì)紫蘇葉多糖得率也有一定影響。當(dāng)濃度為60%時(shí)，紫蘇葉多糖的得率最高，為（5.02±0.06）%，隨著乙醇濃度的增大，得率有所下降，可能是乙醇增加了體系中溶液的總量，降低了體系中紫蘇葉多糖溶液的濃度，從而不利于沉淀的形成，因此選擇60%醇沉濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)三因素三水平17組響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化紫蘇葉多糖的提取條件。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 3 Results of Box-Behnken design

續(xù)表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)Continue table 3 Results of Box-Behnken design

2.2.2 方差分析和二次多項(xiàng)回歸方程擬合

利用Design-Expert 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次回歸方程為Y=5.24+0.19A+0.051B+0.14C+0.012AB+0.093AC+0.025BC-0.59A2-0.30B2-0.68C2。表4為響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析。

表4 方差分析Table 4 Variance analysis

由表 4可知，F(xiàn)值為302.58，p＜0.01，表示該回歸模型極顯著，擬合情況較好，能夠良好地反映出各因素對(duì)紫蘇葉多糖得率的影響。失擬項(xiàng)p＞0.05，表明此模型擬合度良好，非試驗(yàn)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不大。相關(guān)系數(shù)R2和校正決定系數(shù)R2（Adj）分別為0.997 4和0.994 1，表示此模型能較好預(yù)測(cè)紫蘇葉多糖得率，試驗(yàn)結(jié)果與分析結(jié)果差異較小，具有較高的可信度。由F值可知，3個(gè)因素對(duì)紫蘇葉多糖得率的影響程度為A>C>B，即料液比＞醇沉濃度＞提取時(shí)間。

2.2.3 各因素交互作用分析

各因素交互作用的響應(yīng)面和等高線如圖4所示。

圖4 各因素交互作用對(duì)多糖得率的影響Fig.4 Effects of interaction of various factors on the yield of polysaccharides

由圖4可知，響應(yīng)面的開口均向下，曲面呈中間凸四周凹的形狀，說明曲面有最高點(diǎn)，即存在最優(yōu)條件。響應(yīng)面圖可以直觀反映出各因素對(duì)紫蘇葉多糖得率的影響，曲面越陡，影響越大，曲面越平緩，影響越小。可以發(fā)現(xiàn)料液比與醇沉濃度對(duì)紫蘇葉多糖得率的影響高于其他2組，且交互作用顯著，與表4方差分析結(jié)果一致。

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)得出紫蘇葉多糖最佳提取條件為料液比1∶31.66（g/mL）、提取時(shí)間4.09 h、醇沉濃度61.14%，此時(shí)紫蘇葉多糖得率為5.27%。在實(shí)際提取過程中將提取修正條件為料液比1∶30（g/mL）、提取時(shí)間4 h、醇沉濃度60%，利用修正條件重復(fù)3次提取紫蘇葉多糖，多糖得率為（5.22±0.17）%。實(shí)際得率與預(yù)測(cè)得率相差較小，說明用此模型預(yù)測(cè)紫蘇葉多糖得率可行。

2.3 紫蘇葉多糖的總糖含量測(cè)定

根據(jù)1.4中試驗(yàn)方法測(cè)定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖5所示。

圖5 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of glucose

由圖5可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=5.02x+0.1153，R2=0.9992，經(jīng)計(jì)算得出PFP總糖含量為（89.73±0.23）%。

2.4 理化特性分析

2.4.1 差示掃描量熱分析

差示掃描量熱法常被用來檢測(cè)物質(zhì)的熱穩(wěn)定性，該方法可以分析不同溫度下物質(zhì)物理性質(zhì)的變化[25]。圖6為PFP的差示掃描量熱圖。

圖6 PFP的差示掃描量熱圖Fig.6 Differential scanning calorimetry spectrum of PFP

由圖6可以發(fā)現(xiàn)，PFP在75.5℃處出現(xiàn)一個(gè)吸熱峰，可能是紫蘇葉多糖在保存過程中吸潮，水分蒸發(fā)而產(chǎn)生。在整個(gè)升溫過程中，多糖沒有出現(xiàn)放熱峰，說明紫蘇葉多糖具有良好的熱穩(wěn)定性。

2.4.2 熱穩(wěn)定性分析

利用熱重分析儀對(duì)PFP的熱解過程進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖7所示。

圖7 PFP的熱重結(jié)果分析Fig.7 TGA analysis of PFP

由圖7可知，PFP的熱解過程主要分為2個(gè)階段：第一階段在44.78℃，出現(xiàn)1個(gè)失重峰，這個(gè)失重峰可以理解為PFP樣品失去了吸附水，失重為9.394%，這可能是由于PFP在制備或者后續(xù)樣品的較長(zhǎng)保存時(shí)間中發(fā)生了吸潮。第二階段熱解過程在200℃～400℃，此階段的失重最為明顯，表明PFP在200℃～400℃范圍內(nèi)發(fā)生劇烈的分解，這同樣說明在200℃以下PFP具有較好的熱穩(wěn)定性。

2.4.3 X-射線衍射分析

X-射線衍射圖譜能反映樣品的晶體結(jié)構(gòu)，晶體結(jié)構(gòu)越強(qiáng)，衍射峰越強(qiáng)。通常晶體會(huì)出現(xiàn)尖又窄的特征峰，非晶體的峰型多表現(xiàn)為寬而彌散[26]。圖8為PFP的XRD圖譜。

圖8 PFP的X-射線衍射結(jié)果Fig.8 X-ray diffraction pattern of PFP

從圖8可以看出，在21°左右出現(xiàn)1個(gè)較寬的衍射峰，這是PFP主要的結(jié)晶反射區(qū)，譜圖中沒有尖峰出現(xiàn)，這表明PFP無結(jié)晶現(xiàn)象，是一種無定型結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化確定了紫蘇葉多糖的最佳提取工藝條件為料液比1∶30（g/mL）、提取時(shí)間4 h、醇沉濃度60%，此條件下得率最高，達(dá)到（5.22±0.17）%。經(jīng)分離純化后的均一組分多糖PFP的總糖含量為（89.73±0.23）%。理化特性試驗(yàn)結(jié)果表明PFP有較好的熱穩(wěn)定性，其熱解過程主要分為2個(gè)階段，無結(jié)晶現(xiàn)象，是一種無定型結(jié)構(gòu)。總體而言，通過此提取條件得到的紫蘇葉多糖得率較高，熱穩(wěn)定性較好，對(duì)紫蘇葉多糖的研究有進(jìn)一步探索，并為紫蘇葉的應(yīng)用開發(fā)提供一定參考。