湖南地區(qū)冠心病患者中醫(yī)證型與MTHFR C677T基因多態(tài)性、血漿Hcy表達(dá)水平關(guān)系的探討*

張 貞，陸小琪，盧晴晴，周 輝，石盛潔，胡 燕，謝小兵△

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與病理中心，湖南長沙 410007；2.長沙醫(yī)學(xué)院第一臨床學(xué)院，湖南長沙 410219

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(CHD)簡稱冠心病，在中醫(yī)中又稱為“胸痹心痛”，具有高致病率和高致死率的特點(diǎn)[1]。近年來，我國采用中西醫(yī)結(jié)合的方式對(duì)CHD進(jìn)行防治，取得了較好的效果。辨證論治是中醫(yī)理論的核心，在中醫(yī)治療過程中至關(guān)重要。臨床辨證分型在診治過程中具有一定主觀性，缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，需要進(jìn)一步利用西醫(yī)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行佐證。多項(xiàng)流行病學(xué)研究表明，血漿同型半胱氨酸(Hcy)水平異常升高與高血壓、高血脂、糖尿病等一些傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素一樣，已成為CHD發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一，與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)[2-3]；MTHFR C677T基因多態(tài)性與血漿Hcy水平密切相關(guān)，可作為CHD發(fā)病的危險(xiǎn)因素[4]。因此，有必要對(duì)CHD患者中醫(yī)證型與MTHFR C677T基因多態(tài)性、血漿Hcy關(guān)系進(jìn)行深入探討。

目前，CHD中醫(yī)證型與血漿Hcy水平及與MTHFR C677T基因多態(tài)性的關(guān)系研究在湖南地區(qū)尚鮮見相關(guān)報(bào)道。為了進(jìn)一步探討CHD中醫(yī)證型的客觀化指標(biāo)，本研究通過對(duì)湖南地區(qū)的223例CHD患者進(jìn)行了中醫(yī)辨證分型，同時(shí)進(jìn)行MTHFR C677T基因型及血漿Hcy的檢測(cè)，并將性別差異納入研究，分析MTHFR C677T的基因多態(tài)性和等位基因的頻率與CHD患者中醫(yī)證型分布情況，分析不同性別之間MTHFR C677T、血漿Hcy水平的差異，為從遺傳學(xué)角度探討CHD的病因、病理機(jī)制及診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年10月至2020年9月在湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院確診的223例CHD患者為CHD組，另選擇同期進(jìn)行健康體檢的體檢健康者147例為對(duì)照組，兩組年齡均在40歲以上。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1CHD組 (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：所選入的CHD患者西醫(yī)的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)《不穩(wěn)定性心絞痛診斷和治療建議》[5]及《冠心病心絞痛常見證型診斷標(biāo)準(zhǔn)量表》標(biāo)準(zhǔn)[6]及第九版《內(nèi)科學(xué)》[7]。中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)按照《中華人民共和國中醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)·中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》[8]原則及第十一版的《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》[9]胸痹心痛的中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)。此次入選患者每份病例的中醫(yī)辨證分型均由2名副主任醫(yī)師及以上職稱的中醫(yī)專家進(jìn)行辨證，保證辨證的一致性和準(zhǔn)確性，不一致的辨證將予以剔除。既往有CHD病史，典型心絞痛發(fā)作史；個(gè)體間無血緣關(guān)系的長期在湖南地區(qū)生活的自然人群；無多臟器功能衰竭的病理表現(xiàn)；無血液系統(tǒng)疾病；無自身免疫系統(tǒng)疾病及其他嚴(yán)重影響上述疾病的指標(biāo)。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：患有全身急、慢性感染性疾病，嚴(yán)重創(chuàng)傷或腫瘤，嚴(yán)重的急慢性肝、腎功能不全，自身免疫性疾病，骨髓移植術(shù)，風(fēng)濕性瓣膜性心臟病，嚴(yán)重的血液病及其他影響炎癥指標(biāo)的患者。

1.2.2對(duì)照組 (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：個(gè)體間無血緣關(guān)系且在湖南地區(qū)長期生活的自然人群，經(jīng)肝腎功能、心肌酶、電解質(zhì)、心電圖、血常規(guī)、血脂血糖、彩超等常規(guī)檢查證實(shí)無心、肝、腎等臟器器質(zhì)性及功能性病變者。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：同CHD組。

1.3研究方法 所有研究對(duì)象均采集靜脈空腹血約5 mL，并告知研究對(duì)象于采血前1天飲食盡量清淡，禁止暴飲暴食、食用辛辣刺激、高脂肪的食物及吸煙飲酒等。每位受試者均需要采集兩管血液，分別置于含有EDTA抗凝管及普通血清管中，用于DNA提取、血漿Hcy水平及其他生化指標(biāo)的檢測(cè)。采用羅氏Cobas 8000全自動(dòng)生化分析儀，由中國九強(qiáng)生物有限公司提供的試劑測(cè)定血漿Hcy水平，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、肌酐(Cr)、尿素(UREA)、血糖(GLU)、三酰甘油(TG)及總膽固醇(TC)等水平檢測(cè)則是羅氏原裝試劑，試劑靈敏度、特異度高，穩(wěn)定性好，均在控，均嚴(yán)格按照試劑說明及操作規(guī)范要求由熟練的實(shí)驗(yàn)室授權(quán)人員進(jìn)行操作。采用由西安金磁納米生物技術(shù)有限公司提供的試劑提取DNA(磁珠法)，將采集的EDTA抗凝血提取DNA后密封放置于-20 ℃以下的冰箱中保存，集中分析受試者M(jìn)THFR C677T基因型。

MTHFR C677基因檢測(cè)試劑盒購自西安金磁納米生物技術(shù)有限公司(PCR-金磁微粒層析法)。分別取兩個(gè)無菌0.2 mL PCR薄壁管，在管蓋上依次標(biāo)注“M”、“WT”。將29 μL擴(kuò)增液(M)加入標(biāo)有“M”的管中，將29 μL擴(kuò)增液(WT)加入標(biāo)有“WT”的管中，再將1 μL反應(yīng)液分別加入“M”管和“WT”管中，瞬離。再分別加3 μL待測(cè)基因組DNA入“M”、“WT”管中，最后再分別加入17 μL ddH2O，最終兩管總體積均為50 μL。分別將標(biāo)識(shí)清楚的PCR管放入PCR儀中按照設(shè)定的程序進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后，將檢測(cè)卡取出，分別將擴(kuò)增好的“M”管與“WT”管的PCR產(chǎn)物分別滴加在檢測(cè)卡“M”和“WT”的樣品墊處，等待2～5 min判讀結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1CHD各證型組一般資料及證型比例分布 對(duì)CHD各證型組所占比例分析表明，湖南地區(qū)CHD的中醫(yī)證型主要有痰濁中阻證、痰瘀痹阻證、氣陰兩虛證、氣滯血瘀證、寒凝心脈證、心腎陽虛證、心腎陰虛證等。由于各個(gè)中醫(yī)證型入組病例存在差異，寒凝心脈證、心腎陽虛證、心腎陰虛證等幾種證型樣本量較少，故本研究對(duì)CHD中醫(yī)證型的研究主要集中在痰濁中阻證、痰瘀痹阻證、氣陰兩虛證及氣滯血瘀證。結(jié)果表明，樣本數(shù)占比例最大的為氣陰兩虛證組92例(41.26%)，其次為痰瘀痹阻證組49例(21.97%)，痰濁中阻證組43例(19.28%)，氣滯血瘀證組39例(17.49%)。CHD各證型組年齡、ALT、Cr、UREA、GLU、TG及TC等水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 CHD各證型組一般資料表

2.2CHD各證型組血漿Hcy水平比較 通過對(duì)CHD組與對(duì)照組的血漿Hcy水平進(jìn)行比較，結(jié)果顯示CHD組總的血漿Hcy水平顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-4.715，P<0.01)，CHD組中血漿Hcy水平在男女比較中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.345，P=0.179)，但是對(duì)照組中男性血漿Hcy水平高于女性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-5.478，P<0.01),見圖1A。通過對(duì)CHD各證型組血漿Hcy平均水平依次升高的順序?yàn)樘禎嶂凶枳C組、氣陰兩虛證組、痰瘀痹阻證組、氣滯血瘀證組。結(jié)果表明，痰瘀痹阻證組、痰濁中阻證組、氣陰兩虛證組均大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，氣滯血瘀證組與對(duì)照組血漿Hcy水平相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1B。

注：A表示CHD組與對(duì)照組血漿Hcy水平比較；B表示CHD各證型組與對(duì)照組血漿Hcy水平比較。圖1 CHD組血漿Hcy水平柱狀圖

2.3CHD各證型組與對(duì)照組MTHFR C677T基因型頻率和等位基因頻率比較 通過對(duì)MTHFR C677T基因型和等位基因頻率在CHD各中醫(yī)證型組與對(duì)照組之間的比較，結(jié)果顯示痰瘀痹阻證組以CC型為主(61.22%)，痰濁中阻證組以CT型為主(48.84%)，氣陰兩虛證組以CC型為主(42.39%)；痰瘀痹阻證組、痰濁中阻證組、氣滯血瘀證組、氣陰兩虛證組與對(duì)照組比較，MTHFR C677T基因型的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與痰瘀痹阻證組相比，痰濁中阻證組CC基因型頻率小于痰瘀痹阻證組，而CT基因型頻率則大于痰瘀痹阻證組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MTHFR C677T等位基因頻率差異，氣滯血瘀證組與對(duì)照組相比，C等位基因頻率要小于對(duì)照組，而T等位基因頻率則大于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；氣陰兩虛證組與對(duì)照組相比，C等位基因頻率小于對(duì)照組，而T等位基因的頻率則大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。氣滯血瘀證組C等位基因頻率小于痰瘀痹阻證組，而T等位基因的頻率大于痰瘀痹阻證組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。氣陰兩虛證組C等位的頻率小于痰瘀痹阻證組，而T等位基因的頻率要大于痰瘀痹阻證組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 CHD各證型組與對(duì)照組MTHFR C677T基因型頻率和等位基因頻率[n(%)]

2.4不同性別CHD各證型組與對(duì)照組MTHFR C677T基因型頻率比較 通過對(duì)CHD各中醫(yī)證型組與對(duì)照組之間不同性別的MTHFR C677T基因型頻率的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在男性CHD患者各中醫(yī)證型組及與對(duì)照組相比MTHFR C677T基因型差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。女性CHD患者中，痰濁中阻證組CC基因型頻率小于對(duì)照組，而CT、TT基因型頻率大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；氣滯血瘀證組CC基因型頻率小于對(duì)照組，而CT、TT基因型頻率大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 不同性別CHD各證型組與對(duì)照組MTHFR C677T基因型頻率[n(%)]

2.5不同性別CHD各證型組與對(duì)照組MTHFR C677T等位基因頻率比較 對(duì)各組等位基因頻率比較發(fā)現(xiàn)，氣滯血瘀證組C等位基因頻率小于痰瘀痹阻證組，而T等位基因頻率要大于痰瘀痹阻證組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；痰濁中阻證組C等位基因頻率小于對(duì)照組，而T等位基因頻率大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；氣滯血瘀證組C等位基因頻率小于對(duì)照組，而T等位基因的頻率大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；氣陰兩虛證組C等位的頻率小于對(duì)照組，而T等位基因的頻率大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在對(duì)照組中，男性C等位基因頻率小于女性，而T等位基因頻率大于女性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 不同性別CHD各證型組與對(duì)照組MTHFR C677T等位基因頻率[n(%)]

3 討 論

本研究表明，湖南地區(qū)CHD中醫(yī)辨證分型主要以痰濁中阻證、痰瘀痹阻證、氣陰兩虛證及氣滯血瘀證為主，其中氣陰兩虛證所占比例最大。這與葛永彬等[10]報(bào)道的我國近28年CHD居前3位的中醫(yī)證型為氣虛血瘀證、心血瘀阻證、痰阻心脈證的統(tǒng)計(jì)結(jié)果相似。畢穎斐等[11]對(duì)不同地區(qū)的10 065例CHD患者中醫(yī)證型分布特點(diǎn)的研究發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)CHD患者的證型存在差異，其中，氣虛血瘀證和痰阻心脈證以華東地區(qū)多見，痰瘀互結(jié)證以華北地區(qū)多見，而氣虛血瘀和氣陰兩虛證則以華中地區(qū)多見。畢文霞等[12]對(duì)全國536份名老中醫(yī)治療CHD的案例分析得出，從證型要素來看血瘀和氣虛在所有證型要素所占的比例比較高的結(jié)論。在實(shí)際臨床診治過程中，各地區(qū)CHD中醫(yī)辨證分型在分布上具有各自不同的特征，這可能與不同地區(qū)的氣候環(huán)境、飲食結(jié)構(gòu)等因素的差異相關(guān)。

在CHD的發(fā)生、發(fā)展過程中，血漿Hcy水平可作為CHD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素而得到臨床廣泛認(rèn)知與重視。高表達(dá)水平Hcy誘導(dǎo)大量氧化物質(zhì)生成，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，修飾低密度脂蛋白，形成泡沫細(xì)胞，上調(diào)血小板活性，促使糖脂沉積，從而加重動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展[13]。本研究表明，湖南地區(qū)CHD患者血漿Hcy表達(dá)水平高于對(duì)照組，CHD各證型組血漿Hcy的表達(dá)水平依次升高的順序?yàn)樘禎嶂凶枳C組、氣陰兩虛證組、痰瘀痹阻證組、氣滯血瘀證組；其中痰瘀痹阻證組、痰濁中阻證組、氣陰兩虛證組血漿Hcy表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，血漿Hcy表達(dá)水平對(duì)于CHD中醫(yī)辨證分型具有一定的參考意義。值得注意的是，在對(duì)照組中男性血漿Hcy表達(dá)水平明顯高于女性。多項(xiàng)研究表明，血漿Hcy表達(dá)水平存在性別的差異，在健康成人中男性血漿Hcy表達(dá)水平高于女性，女性絕經(jīng)后高于絕經(jīng)前，這種變化可能與雌激素的水平有關(guān)[14-17]，在使用血漿Hcy表達(dá)水平作為CHD的危險(xiǎn)因素時(shí)須將性別差異納入進(jìn)來。有研究證明，Hcy表達(dá)水平與性別的相關(guān)性可能與以下幾個(gè)方面的因素有關(guān)[17-19]：(1)雌激素可能會(huì)干擾Hcy的代謝產(chǎn)物之一蛋氨酸的代謝；(2)男性的骨骼肌較女性更發(fā)達(dá)；(3)男女性飲食結(jié)構(gòu)不同，導(dǎo)致男性葉酸攝入不足。因此，高血漿Hcy表達(dá)水平對(duì)CHD的中醫(yī)辨證分型有一定的參考意義，在探討CHD各中醫(yī)證型組血漿Hcy表達(dá)水平相關(guān)性時(shí)須考慮性別的因素。

隨著人類基因組計(jì)劃的實(shí)施推進(jìn)與任務(wù)完成，CHD基因多態(tài)性機(jī)制的研究越來越受到關(guān)注。血漿Hcy水平作為冠心病一個(gè)重要的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其代謝關(guān)鍵酶中MTHFR基因多態(tài)性可明顯影響血漿Hcy血液濃度，進(jìn)而影響冠心病的疾病的發(fā)生和發(fā)展。研究表明，MTHFR C677T位點(diǎn)突變是目前所發(fā)現(xiàn)的MTHFR 基因30多種突變類型中最常見的一種不耐熱錯(cuò)義突變，MTHFR C677T基因多態(tài)性與血漿Hcy水平密切相關(guān)，可作為CHD發(fā)病的危險(xiǎn)因素[4]。本研究表明MTHFR C677T不同的基因型分布頻率在湖南地區(qū)CC型以痰瘀痹阻證組(61.22%)、氣陰兩虛證組(42.39%)為主，CT型以痰濁中阻證組為主(48.84%)，氣陰兩虛證、氣滯血瘀證患者與T等位基因的突變具有一定相關(guān)性，MTHFR C677T各基因型的分布在男性CHD患者中未見明顯差異，在女性CHD患者中TT型及CT型基因突變以痰濁中阻證、氣滯血瘀證為主。這些研究結(jié)果與前人一系列研究成果相類似：陳建東等[20]研究表明，胸痹心血瘀阻證、痰阻心脈證與MTHFR基因具有相關(guān)性；毛仁芳等[21]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR C677T的基因多態(tài)性的改變?cè)谑澜绮煌赜颉⒎N族、不同的民族群體之間均發(fā)現(xiàn)了明顯的差異；萬莉娟等[22]對(duì)比山東、云南、河南等地區(qū)女性的MTHFRC 677T各基因型分布進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)的基因型分布也存在一定差異；田宇等[23]報(bào)道，無錫女性的MTHFR C677T位點(diǎn)中TT型純合子的分布頻率低于CC型及CT型，與山東省、河南省相比，TT型純合子基因型分布頻率情況相反。因此，MTHFR C677T的基因多態(tài)性分布頻率及等位基因的突變對(duì)于CHD中醫(yī)辨證分型具有一定的參考意義，同時(shí)在CHD防治過程中分析患者M(jìn)THFR C677T基因型時(shí)需要適當(dāng)?shù)乜紤]性別差異。

近年來，關(guān)于中醫(yī)證型與西醫(yī)臨床指標(biāo)及基因的相關(guān)性研究隨著分子診斷技術(shù)的不斷發(fā)展越來越多，體現(xiàn)了中西醫(yī)結(jié)合個(gè)體化醫(yī)療的特色優(yōu)勢(shì)。湖南地區(qū)CHD患者中醫(yī)各證型的分布情況與MTHFR C677T基因多態(tài)性及血漿Hcy水平存在一定的相關(guān)性，在探討CHD各中醫(yī)證型組與MTHFR C677T基因多態(tài)性及血漿Hcy水平相關(guān)性時(shí)需考慮性別因素。值得注意的是，因?yàn)楦鞯匮芯拷Y(jié)果之間存在一定的差異，中醫(yī)辨證分型的標(biāo)準(zhǔn)目前尚未完全統(tǒng)一，可能存在一定的統(tǒng)計(jì)偏差，下一步仍將進(jìn)行中西醫(yī)結(jié)合多中心研究，以實(shí)現(xiàn)更多的臨床價(jià)值，為中醫(yī)證候研究提供新的循證依據(jù)。