納米肉桂油乳液的制備及其對(duì)阪崎克羅諾桿菌抑菌性的研究

鄭淼，張競文，荊高祥，宋丹靚敏，滿朝新，姜毓君

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150030）

0 引言

克羅諾桿菌是是嬰兒配方乳粉中最具危害性的機(jī)會(huì)性食源性致病菌之一，其中阪崎克羅諾桿菌的來源最廣，其攝入可能會(huì)導(dǎo)致嬰兒菌血癥、小腸結(jié)腸炎、和腦膜炎等惡性疾病[1-3]。現(xiàn)有的抑菌劑多以化學(xué)合成為主，因其存在一定的毒副作用、不易降解等問題，制備一種安全有效的天然抑菌劑尤為重要。

植物精油含有芳香類化合物、萜類化合物、含氮含硫化合物等抑菌活性成分，具有廣譜的抑菌活性，是良好的天然抑菌劑[4-5]。納米乳化體系是由水相、油相、表面活性劑按比例制成粒徑在50～500 nm之間的透明或半透明乳化運(yùn)輸體系[6-7]。納米乳具有極高的熱力學(xué)穩(wěn)定性[8]。精油的強(qiáng)揮發(fā)性、疏水性等問題可以通過納米乳化體系進(jìn)行改善，并且可在一定程度上提高抑菌作用[9]。迄今為止，將植物精油用納米乳液包埋并應(yīng)用于食品抑菌已有大量的報(bào)道[10-12]。

本研究采用高壓均質(zhì)技術(shù),以乳清分離蛋白(whey protein isolated，WPI)作為乳化劑制備肉桂油納米乳液，通過響應(yīng)面法優(yōu)化肉桂油納米乳液制備工藝，以肉桂油納米乳液粒徑作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，明確最佳工藝參數(shù)。在此基礎(chǔ)上采用濾紙片法探究肉桂油納米乳液抑菌性能。以期為制備安全、高穩(wěn)定性的天然活性抑菌產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544、阪崎克羅諾桿菌ATCC 29004、阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894、金黃色葡萄球菌ATCC 13565、大腸桿菌ATCC 25922，購買于中國普通微生物菌株保藏管理中心。

1.1.2 試劑與材料

乳清分離蛋白，美國希爾瑪配料公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；LB肉湯培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；丙三醇，北京新光化工試劑廠。

1.2 儀器設(shè)備

高壓均質(zhì)機(jī)，英國Stansted Fluid Power公司；電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；Vortex-Genie2型振蕩器，上海一恒科技有限公司；JJ-1增力電動(dòng)攪拌器，江蘇金城國勝儀器廠；Zatasizer Nano-ZS 90型光散射粒度分析，英國Malvern儀器有限公司；超凈工作臺(tái)，美國PE公司；精密電子天平，瑞士梅特勒-托利多有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 肉桂油納米乳液的制備

將WPI均勻溶于磷酸緩沖液（10 mmol/L p H=7）后，加入1 mL的肉桂油。將制成的懸浮液于室溫中用磁力攪拌器攪拌1 h。之后在室溫下以20 000 r/min粗均2 min。粗均完成之后進(jìn)行高壓均質(zhì)[13-14]。

1.3.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)基本條件定為：WPI添加量1.5%，均質(zhì)壓力120 MPa，均質(zhì)循環(huán)次數(shù)6次。因素實(shí)驗(yàn)條件為WPI添加量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、均質(zhì)壓力（80、100、120、140、160 MPa）和均質(zhì)循環(huán)次數(shù)（2、4、6、8、10次），分別考察WPI添加量、均質(zhì)壓力、均質(zhì)循環(huán)次數(shù)對(duì)肉桂油納米乳液的平均粒徑、蛋白質(zhì)分散系數(shù)（protein dispersibility index，PDI）的影響。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過Design-Expert軟件Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分析了WPI添加量（X1）、壓力（X2）、循環(huán)次數(shù)（X3）3個(gè)因素之間的相互作用對(duì)肉桂油納米乳液粒徑所產(chǎn)生的影響。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 肉桂油納米乳液制備Box-Behnken試驗(yàn)因素和水平

1.3.4 肉桂油納米乳液濾紙片抑菌活性試驗(yàn)

細(xì)菌懸液的制備：分別在20 m L LB肉湯中加入200μL甘油凍存的菌液，放入37℃、150 rpm/min搖床中培養(yǎng)6 h，制備成104～105CFU/mL的菌懸液。

肉桂油納米乳液抑菌試驗(yàn)：將培養(yǎng)好的菌液按4%的比例混入滅菌60℃待凝固培養(yǎng)基中，輕微搖晃混勻，避免氣泡產(chǎn)生。取待凝固混菌培養(yǎng)基15～20 mL倒入滅菌培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固。

濾紙片抑菌法：用無菌的圓濾紙片（d=6 mm）浸泡于肉桂油納米乳液中2 h，瀝干后貼在含菌平板上。以浸泡2 h磷酸緩沖液（10 mmol/L p H=7），以蒸餾水處理后的無菌濾紙片為對(duì)照。將平板于37℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈大小。每處理重復(fù)3次，取平均值[15-16]。

1.3.5 肉桂油納米乳液貯藏穩(wěn)定性試驗(yàn)

將肉桂油納米乳液在4、25、55℃條件下貯藏28 d，每隔7 d進(jìn)行取樣，測定其粒徑大小。每個(gè)樣品重復(fù)測定3次，取平均值[17]。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 肉桂油納米乳液最佳WPI添加量的確定

不同WPI添加量對(duì)肉桂油納米乳液的平均粒徑及PDI影響結(jié)果如圖1所示。WPI的添加量由0.5%增長至1.5%過程中，肉桂油納米乳液粒徑大小及PDI隨著WPI添加量的增大逐漸降低，說明肉桂油納米乳液的界面乳化層在WPI與肉桂油之間的交互作用下更加致密[18]。其主要原因可能是：較高濃度的乳化劑可以使乳化劑較快的吸附到肉桂油表面，更有效的防止聚結(jié)；在較高濃度的乳化劑下，均質(zhì)過程中可以有更多的乳化劑分子用于包裹油滴[19]。當(dāng)WPI添加量高于1.5%之后，肉桂油納米乳液的平均粒徑并未進(jìn)一步降低，差異不顯著（P＞0.05）,PDI則略有回升。其原因可能是：由于WPI和肉桂油的結(jié)合已經(jīng)飽和，并沒有足夠的肉桂油與更多的WPI形成致密的乳化界面層。另一方面，過量的WPI在均質(zhì)作用下形成部分粒徑較小的WPI納米乳滴，擴(kuò)大了乳液的粒徑分布范圍，從而使得PDI值的增大[20]。故將高壓均質(zhì)法制備肉桂油納米乳液中WPI的添加量確定為1.5%較適宜。

圖1 肉桂油納米乳液最佳WPI添加量的確定

2.1.2 肉桂油納米乳液最佳均質(zhì)壓力的確定

肉桂油納米乳液的平均粒徑及PDI影響結(jié)果如圖2所示。均質(zhì)壓力由80 MPa增長到120 MPa的過程中，肉桂油納米乳液的平均粒徑及PDI逐漸降低。其原因可能是：乳液顆粒在巨大的機(jī)械作用力下粒徑逐漸減小形成納米乳滴。在不斷增加的均質(zhì)壓力作用下，乳粒徑進(jìn)一步減小，分布更加均一[21]。但當(dāng)壓力超過120 MPa后，粒徑及PDI反而隨壓力增大而增加。其原因可能是：分散相比表面積在過高的壓力、機(jī)械作用力的作用下急劇增加，有限的WPI不足以完全覆蓋液滴表面，降低了WPI的乳化作用，乳液相互聚集，進(jìn)而破壞了乳液的穩(wěn)定性，乳液粒徑增大。另外，過高的壓力使得均質(zhì)的機(jī)械能轉(zhuǎn)換為熱能，導(dǎo)致乳液溫度升高，部分乳液發(fā)生相變，影響粒徑大小[22]。故將高壓均質(zhì)法制備肉桂油納米乳液中均質(zhì)壓力確定為120 MPa較適宜。

圖2 肉桂油納米乳液最佳均質(zhì)壓力的確定

2.1.3 肉桂油納米乳液最佳均質(zhì)循環(huán)次數(shù)的確定

肉桂油納米乳液最佳均質(zhì)循環(huán)次數(shù)的確定如圖3所示。均質(zhì)循環(huán)次數(shù)在6次之前時(shí)，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，肉桂油納米乳液粒徑逐漸下降，其原因可能是：循環(huán)次數(shù)較少時(shí)，并非所有的液滴都會(huì)受到同樣強(qiáng)烈的均勻化能量，因此一部分粗乳液的尺寸并沒有減小，這也導(dǎo)致了乳液的均勻性受到影響，PDI增加。隨著均質(zhì)次數(shù)的不斷增加，乳液中未被均質(zhì)細(xì)化的大乳滴也被持續(xù)的均質(zhì)打碎成小乳滴，乳液變得更加穩(wěn)定。然而，納米乳液的平均粒徑在均質(zhì)次數(shù)超過6次后與均質(zhì)次數(shù)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，其原因可能是：大量的能量引起了乳液高頻的聚集，使得均質(zhì)過程中出現(xiàn)了“過處理現(xiàn)象”[23]。故將高壓均質(zhì)法制備肉桂油納米乳液中均質(zhì)循環(huán)次數(shù)確定為6次較適宜。

圖3 肉桂油納米乳液最佳均質(zhì)循環(huán)次數(shù)的確定

2.2 肉桂油納米乳液制備響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken試驗(yàn)方案

將單因素試驗(yàn)所明確的高壓均質(zhì)法制備肉桂油納米乳液工藝中的最佳條件，通過統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert 8.0.6.1設(shè)計(jì)優(yōu)化響應(yīng)面。以WPI添加量（X1）、均質(zhì)壓力（X2）、循環(huán)次數(shù)（X3）為自變量，肉桂油納米乳液粒徑大小為響應(yīng)值，采取Box-Behnken的3因素3水平試驗(yàn)共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，前12個(gè)是析因點(diǎn)，自變量取值在X1，X2，X3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)；后5個(gè)為零點(diǎn)，為區(qū)域的中心點(diǎn)，用來評(píng)估試驗(yàn)誤差[24]。

高壓均質(zhì)法制備肉桂油納米乳液Box-Behnken試驗(yàn)方案與結(jié)果見表2。

表2 高壓均質(zhì)法制備肉桂油納米乳液Box-Behnken試驗(yàn)方案與結(jié)果

2.2.2 模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert 8.0.6.1軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到肉桂油納米乳液對(duì)WPI添加量、均質(zhì)壓力、循環(huán)次數(shù)的二次多項(xiàng)回歸模型為：

Y=106.00-4.63X1-6.50X2-8.88X3+2.75X1X2+0.50X1X3+5.25X2X3+8.50X12+22.25X22+15.00X32

其中整體模型項(xiàng)為極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說明方程和試驗(yàn)擬合較好，可以對(duì)高壓均質(zhì)法制備肉桂油納米乳液所設(shè)置的不同參數(shù)下對(duì)于肉桂油納米乳液的粒徑進(jìn)行預(yù)測。

由表3可知各因素對(duì)肉桂油納米乳液粒徑影響程度大小的排序?yàn)椋壕|(zhì)壓力（X2）＞均質(zhì)循環(huán)次數(shù)（X3）＞W(wǎng)PI添加量（X1）。

表3 肉桂油納米乳液粒徑的方差分析

（續(xù)表3）

2.2.3 分析響應(yīng)面及二維等高線圖

肉桂納米油乳液制備工藝中各因素交互作用的響應(yīng)面及二維等高線圖分別見圖4、圖5、圖6。

圖4 WPI添加量和均質(zhì)壓力對(duì)肉桂油納米乳液粒徑影響的響應(yīng)面和等高線圖

圖6 均質(zhì)循環(huán)次數(shù)和均質(zhì)壓力對(duì)肉桂油納米乳液粒徑影響的響應(yīng)面和等高線圖

WPI添加量和均質(zhì)壓力對(duì)肉桂油納米乳液粒徑影響的響應(yīng)面和等高線圖分析由圖4所示，當(dāng)WPI添加量一定時(shí)，均質(zhì)壓力增大,肉桂油納米乳液的粒徑先增大后減小；當(dāng)均質(zhì)壓力一定時(shí)，肉桂油納米乳液粒徑隨WPI添加量，呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。

WPI添加量和均質(zhì)壓力的坡度陡峭，等高線較為密集，橢圓曲率較大。說明WPI添加量與均質(zhì)壓力之間交互作用顯著。而且WPI添加量的等高線更為密集，說明WPI添加量的主效大于均質(zhì)壓力。

均質(zhì)循環(huán)次數(shù)和WPI添加量對(duì)肉桂油納米乳液粒徑影響的響應(yīng)面和等高線圖分析由圖5所示，肉桂油納米乳液粒徑隨著均質(zhì)循環(huán)次數(shù)的增加，呈現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢；WPI添加量對(duì)肉桂油納米乳液粒徑與均質(zhì)循環(huán)次數(shù)類似，在均質(zhì)循環(huán)次數(shù)為6次，WPI添加量為1.5%時(shí)，肉桂油納米乳液的粒徑達(dá)到最小。

圖5 均質(zhì)循環(huán)次數(shù)和WPI添加量對(duì)肉桂油納米乳液粒徑影響的響應(yīng)面和等高線圖

均質(zhì)循環(huán)次數(shù)和WPI添加量的坡度陡峭，等高線較為密集，橢圓曲率較大。說明均質(zhì)循環(huán)次數(shù)和WPI添加量之間交互作用顯著。而且均質(zhì)循環(huán)次數(shù)的等高線相較WPI添加量稀疏，說明WPI添加量的主效大于均質(zhì)循環(huán)次數(shù)。

均質(zhì)循環(huán)次數(shù)和均質(zhì)壓力對(duì)肉桂油納米乳液粒徑影響的響應(yīng)面和等高線圖分析由圖6所示，當(dāng)均質(zhì)循環(huán)次數(shù)一定時(shí)，肉桂油納米乳液的粒徑隨著均質(zhì)壓力的增加先增大后減小；當(dāng)均質(zhì)壓力一定時(shí)，隨均質(zhì)循環(huán)次數(shù)的增大而先增大后減小。

均質(zhì)循環(huán)次數(shù)和均質(zhì)壓力的等高線排列疏松且橢圓曲率小，近似圓形。說明均質(zhì)循環(huán)次數(shù)和均質(zhì)壓力之間交互作用不顯著。

2.3 肉桂油納米乳液的抑菌性能

如表4所示，高壓均質(zhì)制備的肉桂納米油乳液對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌，以及不同株的阪崎克羅諾桿菌抑菌效果雖有差異，但均具有良好的抑菌性能，證明該納米肉桂油乳液具有作為天然抑菌劑的潛力。

表4 肉桂油納米乳液的抑菌性能

2.4 肉桂油納米乳液貯藏穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

在4、25、55℃溫度條件下貯藏28 d,肉桂油納米乳液平均粒徑變化如圖7所示。在4℃條件下，儲(chǔ)藏1～7 d，肉桂油納米乳液能夠保持穩(wěn)定，乳液粒徑基本維持不變。在儲(chǔ)藏第7天起到第28天，乳液平均粒徑由105±1.76 nm增大至127±3.24 nm，增加了20.9%。而在25℃、55℃條件下，在儲(chǔ)存第5天時(shí)，乳液的粒徑已經(jīng)開始增大，貯藏28 d后，平均粒徑增加至140±2.75 nm和153±2.14 nm，分別增大了33.3%和45.7%。由此可見，4℃更有利于肉桂油納米乳液的貯藏。分析原因可能是布朗運(yùn)動(dòng)在溫度較高時(shí)更加劇烈，液滴碰撞幾率上升進(jìn)而團(tuán)聚，使得粒徑變大。

圖7 肉桂油納米乳液貯藏穩(wěn)定性

3 結(jié)論

本文在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)確定，肉桂油納米乳液的最佳制備工藝為：WPI添加量1.62%，均質(zhì)壓力121.96 MPa，均質(zhì)循環(huán)次數(shù)5.27次，所得肉桂油納米乳液粒徑為103.889 nm。隨后評(píng)價(jià)了在此條件下制備的肉桂油納米乳液的抑菌性能，結(jié)果表明，該納米乳液對(duì)革蘭氏陰、陽性致病菌均有著較好的抑菌作用，同時(shí)亦展現(xiàn)出較好的阪崎克羅諾桿菌生長抑制的能力。在4、25、55℃下貯藏28 d后，乳液的粒徑有所增加，但仍保持在納米級(jí)粒徑范圍內(nèi)，且在4℃條件下儲(chǔ)存穩(wěn)定性最好