基于HS/SPME-GC/MS分析不同泌乳期母乳的揮發(fā)性成分差異

張鬧，葛武鵬，張艷，高秦藝，何銳，張琦，原卉卉，李帥

（1.西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌712100；2.陜西省羊乳產品質量監(jiān)督檢驗中心，陜西 富平711700；3.陜西百躍優(yōu)利士乳業(yè)有限公司，西安710000；4.陜西省乳品工業(yè)協(xié)會，西安710000）

0 引言

母乳是嬰幼兒最佳的食物來源，營養(yǎng)組成最符合生命早期的嬰幼兒營養(yǎng)需求，富含蛋白質、脂肪、碳水化合物、維生素、礦物質、免疫因子等多種宏量及微量營養(yǎng)素，對于嬰幼兒的生長發(fā)育以及腸道微生態(tài)構建起著至關重要的作用[1]。母乳喂養(yǎng)可減少嬰幼兒患病率，緩解嬰兒的疼痛感、恐懼感，也可以增加嬰幼兒人對新食物的接受度，是嬰幼兒喂養(yǎng)的第一選擇[1-4]，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）和國家衛(wèi)生健康委員會建議嬰兒喂養(yǎng)最優(yōu)方案為前6個月純母乳喂養(yǎng)[1]。而當母親由于工作或身體等原因無法實現(xiàn)母乳喂養(yǎng)時，可選擇以牛、羊乳為基料的嬰幼兒配方奶粉進行喂養(yǎng)。牛、羊乳在營養(yǎng)物質組成和含量方面均與母乳存在著較大差異[5]，因此為滿足嬰幼兒的正常生長發(fā)育，需要對奶粉的各種營養(yǎng)物質進行優(yōu)化使其更接近母乳。

除對嬰幼兒配方奶粉的營養(yǎng)物質進行優(yōu)化外，風味也是“母乳化”的一個重要部分。嬰幼兒對于母乳有自發(fā)或先天的感知力[6]，在母乳喂養(yǎng)的過程中，嬰幼兒可以通過氣味判斷母乳，進而促進他們的吸吮行為[7-9]。嬰幼兒在習慣母乳喂養(yǎng)的嬰幼兒在短時間內難以適應配方奶粉，對其接受度不高甚至不吃。因此研究母乳的風味物質構成及其量效關系，對提高嬰幼兒適應配方奶粉的接受度就具有十分重要的意義。目前，對于母乳風味物質的研究相對較少，多集中在母乳貯藏或處理前后揮發(fā)性成分的變化[10-12]。張麗娜等[11]探究了凍藏條件對母乳揮發(fā)性成分的影響，發(fā)現(xiàn)快速及深低溫恒溫冷凍對母乳風味物質影響較小。

對于母乳風味的研究多使用成熟乳[7,11,13]，而母乳是一個動態(tài)變化的系統(tǒng)，乳的成分會隨著泌乳期的不同而發(fā)生顯著變化，以滿足嬰幼兒不同階段的營養(yǎng)需要[14-15]，同時泌乳階段是影響乳風味的一個重要因素[16]。因此本文基于頂空固相微萃取氣相色譜-質譜聯(lián)用技術(headspace solid phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry，HS/SPMEGC/MS）技術[17]，對不同泌乳期的母乳風味信息進行分析比較，測定其揮發(fā)性成分，旨在理清不同泌乳期母乳揮發(fā)性成分的差異，為研究更接近母乳風味、接受度更高的嬰幼兒配方奶粉提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

不同泌乳期母乳樣品：初乳(0~7 d）、過渡乳（8~30 d）、成熟乳（30 d以后），來自陜西楊凌地區(qū)20~35歲的哺乳期志愿者，所有志愿者均身體健康、母乳充足，無酗酒史，無妊娠高血壓、糖尿病等影響脂質代謝疾病，且均已簽署知情同意書。每種樣品均由來自5~10個健康志愿者的母乳樣品進行混合，混合母乳樣品采用標準化的工具和流程采集，取樣后分裝到50 mL消毒離心管中，在冷鏈條件下轉運至西北農林科技大學乳品加工及質量安全工程技術實驗室，凍存于-80℃冰箱待檢。

1.2 主要試劑

氯化鈉（分析純），廣東光華科技股份有限公司；2,4,6-三甲基吡啶（色譜純），阿拉丁試劑有限公司；甲醇（色譜純），成都市科隆化學品有限公司。

1.3 儀器與設備

GCMS-QP2010Ultra氣相色譜質譜聯(lián)用儀，日本Shimadzu公司；50/30μm DVB/CAR/PDMS涂層萃取頭，美國Supelco公司；DB-WAX毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25μm），美國Agilent公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 揮發(fā)性成分的萃取

本文參考黃豪等[18]的方法，并加以修改。采用頂空固相微萃取的方法提取乳中的揮發(fā)性成分，并以200μg/m L的2,4,6-三甲基吡啶為內標物對揮發(fā)性成分進行半定量分析。首先分別取5 m L初乳、過渡乳、成熟乳母乳樣品分別置于20 mL頂空瓶中，依次加入1.5 g氯化鈉、20μL內標物，迅速擰緊瓶蓋后方可上樣進行后續(xù)揮發(fā)性成分的萃取和分析，所有樣品均取3個平行進行試驗。

HS/SPME條件：采用自動固相微萃取進樣系統(tǒng)AOC-6000，使用已老化的萃取頭對樣品中的揮發(fā)性成分進行萃取，萃取深度為22 mm，萃取時間30 min，解析3 min。

1.4.2 GC/MS檢測條件

GC條件：采用程序升溫模式，起始溫度設定為40℃，保持2 min；以5℃/min的速度升溫到90℃，保持3 min；再以5℃/min的速度升溫到130℃，保持3 min；最后以5℃/min的速度升溫到250℃，保持3 min；進樣口溫度為250℃，載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min，不分流進樣。

MS條件：EI離子源，電子能量70 eV；傳輸線溫度280℃；離子源溫度230℃，四級桿，溫度150℃；質量掃描范圍55~500 u；溶劑延遲3 min。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

利用氣質儀器配套的軟件Xcalibur進行數(shù)據(jù)采集和分析，通過檢索自帶的NIST譜圖庫進行自動匹配定性，選取匹配度大于90（最大值100）的物質，使用Excel軟件對數(shù)據(jù)進行進一步半定量分析，各組分半定量分析公式為：

式中：mi表示未知物質的質量濃度，μg/L；Ai表示未知物質的峰面積，Vi表示頂空瓶中加入未知物質的體積，mL；A0表示內標物的峰面積，m0表示內標物的濃度，μg/L；V0表示頂空瓶中加入內標質的體積，m L。

利用聯(lián)川生物云平臺（https://www.omicstudio.cn/tool）的高級熱圖繪制功能將半定量分析后揮發(fā)性成分的相對含量進行Z-score歸一化處理后即可分析得到熱圖。

2 結果與分析

2.1 總離子流色譜圖

采用頂空固相微萃取技術（HS/SPME)對乳中揮發(fā)性成分進行萃取，經GC/MS分離鑒定，得到初乳、過渡乳、成熟乳的總離子流圖分別如圖1~3所示。3種樣品的出峰時間主要集中在5~52.5 min，且主要揮發(fā)性成分的出峰時間一致。

2.2 揮發(fā)性風味物質分析

通過檢索NIST譜圖庫對圖1~3進行匹配定性，選取匹配度大于90（最大值100）的物質，同時對比同一泌乳期的其他兩個重復處理得出結果，經匹配分析，在3個泌乳期的乳中共檢測出56種揮發(fā)性成分，其中，初乳、過渡乳、成熟乳中分別檢出了39、37、41種，具體如表1所示，主要包括酯類、醇類、烷烴類、醛酮類、酸類以及醚類6大類，正是這些物質構成了母乳獨特的風味。

表1 3種樣品的揮發(fā)性成分成分分析

圖1 初乳的GC/MS總離子流色譜圖

圖2 過渡乳的GC/MS總離子流色譜圖

圖3 成熟乳的GC/MS總離子流色譜圖

（續(xù)表1）

2.2.1 酯類物質

酯類物質是酸類和醇類發(fā)生酯化作用而產生的一種物質，因其普遍具有花果香味，故而是一類良好的風味物質，也是乳制品香氣成分的主要來源之一[19]。由表1可以看出酯類最為豐富，是母乳中主要的風味成分，在初乳、過渡乳、成熟乳中分別有23種、30種、27種，分別占據(jù)對應泌乳期所有乳種類的58.97%、81.08%、65.85%。其中己酸乙酯、辛酸甲酯、辛酸乙酯、癸酸甲酯、癸酸乙酯、月桂酸甲酯和月癸酸乙酯這7種物質在不同泌乳期的乳中均有較高的含量，明顯高于其他酯類物質，對于母乳獨特的風味貢獻很大。然而由于酯類物質的風味閾值很低，所以含量較低的酯類物質對乳獨特的風味也有所貢獻[20]。

本研究共檢測到32種酯類物質，占據(jù)總物質種類的57.14%，張麗娜等[11]在新鮮母乳中檢測到5種酯類物質，總含量為4.39μg/100 mL，分析結果表明酯類物質是母乳中最主要的風味貢獻者，高雅慧等[13]在6個月的成熟乳中檢測到8種酯類物質，占據(jù)總物質種類的23.53%，總含量為4.25%，分析結果表明酯類物質是僅次于酸類物質的一種風味組成部分。艾對等[21]在牛、羊乳中只檢測到了2~3種酯類物質，同時其含量顯著低于酸類物質和烷烴類物質，張曉梅等[22]只在牦牛乳中檢測到了酯類物質，而在奶牛乳和水牛乳中均沒有檢測到，Zhang等[23]在生牛奶中僅檢測到了3種內酯類物質。由此可見，酯類物質是母乳中主要的風味物質，而對于牛、羊乳的風味貢獻較小，因此為使得嬰幼兒配方奶粉的風味更接近母乳，酯類物質需重點模擬。

2.2.2 醇類物質

由表1可以看出在初乳、過渡乳和成熟乳中都存在2-甲基-2-丙醇，其相對含量分別為15.42、6.48、4.44μg/L，呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，艾對[21]在牛乳中發(fā)現(xiàn)了此物質但并未在羊乳中發(fā)現(xiàn)。另外，在初乳中還存在2-甲基-2-丁醇、11-甲基-1-十二醇這兩種物質，相對含量分別為5.78、14.48μg/L，而在過渡乳和成熟乳中均不存在，關于母乳和牛、羊乳的風味物質研究中也未檢測到這兩種物質的存在，可能是由于母體的飲食、生活環(huán)境等導致了此現(xiàn)象的出現(xiàn)[7,16]。另一方面，由于醇類物質的風味閾值較高[20,24]，因此該類物質對母乳的風味貢獻不大。

2.2.3 烷烴類物質

由表1可以看出，不同泌乳期階段母乳的烷烴類物質變化較大，初乳、過渡乳和成熟乳中中分別存在10種、1種、6種烷烴類物質。本研究的初乳和成熟乳中均檢測到了十二烷、苯乙烯和1,3-二叔丁基苯，相對于其他烴類物質的含量較高，張麗娜等[11]的研究也符合該結論，因此可以表明這些物質是母乳中重要的烷烴類物質。除此之外，本研究中發(fā)現(xiàn)僅2,4-甲基-1-庚烯在3種母乳中均存在，相對含量分別為25.96、5.37、3.47μg/L，呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，但未在其他研究中發(fā)現(xiàn)，還有些物質只在一個階段的乳中存在，由此猜測可能是由于母體的飲食、生活環(huán)境等導致了此現(xiàn)象的出現(xiàn)。但另一方面，由于烷烴類物質的風味閾值較高[24]，所以此類物質對于母乳風味的貢獻不大。

2.2.4 醛、酮類物質

醛、酮類物質是乳脂肪氧化的產物，因其具有濃郁的奶香味、甜香味且其風味閾值較低，所以醛、酮類也是一類良好的風味物質[22,25]。由表1可以看出，初乳中不存在醛、酮類物質，過渡乳中存在正己醛和2-壬酮，成熟乳中存在正己醛、反-2-辛烯醛、壬醛、2-茨酮4類物質。

張曉梅對各類牛乳的風味物質進行對比研究發(fā)現(xiàn)甲基酮類物質尤其是2-庚酮、2-壬酮對于牛乳的風味貢獻最大[22]，艾對也發(fā)現(xiàn)牛、羊乳中2-壬酮是除丙酮外主要的醛類風味物質[21]。本研究中發(fā)現(xiàn)，過渡乳中2-壬酮的相對含量為33.82μg/L，是醛、酮類物質中最高的，張麗娜等[11]的研究也符合該結論，因此2-壬酮也同樣是母乳的主要風味貢獻者之一。本研究的成熟乳樣品中還檢測到了2-茨酮，但其他關于母乳和動物乳風味物質的研究中均未檢測到該物質，所以合理猜測可能是母體的飲食、生活環(huán)境等導致了此現(xiàn)象的出現(xiàn)[26]。

另一方面，本研究的母乳中檢測到的正己醛、反-2-辛烯醛、壬醛這3種醛類物質也均在張麗娜和zhang等人的研究[7,11]中檢測到，且正己醛在過渡乳和成熟乳均存在且其相對含量較高，分別為15.20、25.32μg/L，呈現(xiàn)良好青草味，反-2-辛烯醛和壬醛呈現(xiàn)良好的脂肪風味，由此可見，這3種醛類物質均是母乳中重要的風味物質。艾對等[21-22]在牛乳和羊乳中均檢測到了壬醛，而正己醛和反-2-辛烯醛在牛、羊乳中均未被檢測到，所以猜測反-2-辛烯醛和正己醛可能是母乳中特有的風味物質。

2.2.5 酸類物質

由表1可以看出，母乳中存在辛酸、癸酸和月桂酸3種酸類物質，張麗娜等人[7,11,13]的研究中也檢測到了這些物質，由此可見這些物質是母乳中酸類物質的重要組成成分，其中月桂酸的相對含量顯著低于其他兩種物質。另外，張麗娜等人[7,11,13]的研究還發(fā)現(xiàn)了己酸等其他的酸類物質，但本研究中未檢測到，可能是由于檢測條件不同導致這些物質未被提取[7]。已檢測到的物質中僅癸酸在3個泌乳期的乳中均存在，相對含量分別為16.64、461.36、160.34μg/L，呈現(xiàn)先劇增而后減少的趨勢，另外，辛酸和月桂酸僅在過渡乳和成熟乳中存在，成熟乳中其含量同樣低于過渡乳。

艾對等[21]在牛、羊乳中都檢測到的主要酸類物質包括辛酸、月桂酸和己酸，另外在羊乳中還檢測到了癸酸和壬酸，張曉梅等[22]在奶牛乳、水牛乳、牦牛乳均檢測到了己酸、辛酸和癸酸，zhang等[23]在生牛乳中檢測到的主要酸類物質包括辛酸、己酸、癸酸、月桂酸和壬酸。由此可見，母乳中主要呈香酸類物質種類與牛、羊乳相同，但相對含量差異較大。

2.2.6 醚類物質

由表1可以看出，僅初乳中存在對丙烯基茴香醚、乙基叔丁基醚兩種醚類物質，過渡乳和成熟乳中均不存在醚類物質，其他研究中也均未檢測到醚類物質。

為了更直觀地觀察3個泌乳期揮發(fā)性風味物質的差異，將這3個階段的化合物分析結果歸一化后繪制成熱圖，如圖4所示。圖中每一列代表不同的泌乳期的母乳樣品，每一行代表母乳樣品中的化合物，不同顏色的色塊表示這種氣味化合物的相對含量。根據(jù)熱圖，同一泌乳期母乳的不同樣品間的揮發(fā)性風味物質含量差異不大，而不同的泌乳期樣品間存在差異。初乳中的烷烴類、醇類和醚類物質的相對含量明顯高于其他兩個泌乳期，但由于這些物質的風味閾值較低，因而對乳的風味貢獻不大；過渡乳較其他兩種乳樣中的酯類和酸類成分的相對含量更高，因而過渡乳的果香味和汗味、蠟味較其他兩個階段濃[7]；而在成熟乳中醛、酮類物質相對含量較其他兩個階段高，賦予了其濃郁的奶香、甜香味[27]。

圖4 3種樣品揮發(fā)性風味成分含量的熱圖

3 結論

本研究基于HS/SPME-GC/MS技術對不同泌乳期母乳的揮發(fā)性成分種類及其相對含量進行檢測，并分析其差異。研究表明3種母乳樣品共檢出56種揮發(fā)性成分，其中，初乳、過渡乳、成熟乳中分別為39、37、41種，主要包括酯類、醇類、烷烴類、醛酮類、酸類以及醚類等6大類，這些物質以不同的量效表達構成了母乳獨特的風味，風味化學分析可知酯類成分最為豐富，是最主要的風味物質。然而，不同泌乳期乳中揮發(fā)性成分相對含量存在差異，在氣味表達亦如此。過渡乳較其他兩種乳樣中的酯類和酸類成分的相對含量更高，因而過渡乳的果香味和汗味、蠟味較其他兩個階段更濃；而成熟乳因醛、酮類物質相對含量高于其他兩個階段，賦予了其成熟乳濃郁的奶香、甜香味。此外，將本研究結果與牛、羊乳風味進行對比，發(fā)現(xiàn)酯類成分是母乳與動物乳風味存在差異的主因，因此為了使嬰幼兒配方奶粉的滋氣味更接近母乳，酯類物質需重點模擬。本研究可為開發(fā)更接近母乳風味、接受度更高的嬰幼兒配方奶粉提供一定的參考依據(jù)。