藥食同源蔬菜赤蒼藤SCoT 分子標記體系的優化及引物篩選

楊天為，黃詩宇，張尚文，高曼熔，張向軍，李 婷，庾韋花，蒙 平，石 前

（1.廣西壯族自治區農業科學院生物技術研究所 南寧 530007； 2.廣西大學農學院 南寧 530004）

赤蒼藤（Erythropalum scandensBlume）為鐵青樹科赤蒼藤屬多年生常綠大型木質藤本植物，又稱牛耳藤、萎藤、勾華、側莧、細綠藤，主要分布在熱帶及亞熱帶地區，主產地位于華南地區以及貴州、云南等地的中低海拔區域。赤蒼藤作為一種藥用植物被收錄在《廣西藥用植物名錄》[1]中，它也是一種藥食兼用的天然野生植物，嫩葉可作鮮食蔬菜，營養價值豐富、口味鮮美、清香獨特；莖、根可作藥材，莖可利尿醫黃疸、治療風濕骨痛，根可祛水腫，治療跌打損傷[2]。近年來，隨著赤蒼藤的食用和藥用價值獲得人們認可，市場需求也日益增長，而我國熱帶和亞熱帶地區具有豐富的赤蒼藤野生資源，有很大的開發潛力，目前，有關赤蒼藤的研究主要是生產栽培技術[3-4]、品種選育[5]、化學成分分析[6-7]與藥理作用[8]等方面，而有關赤蒼藤種質資源評價與分類、遺傳結構分析等方面的研究還未見報道，因此，對赤蒼藤開展種質間遺傳特性的深入研究可以為赤蒼藤種質資源的收集與保護、品種選育與改良提供理論依據，對推進產業快速發展具有重要意義。

分子標記已經成為研究生物個體間遺傳多樣性的重要手段之一，較常用的分子標記方法有SSR、ISSR、SCoT 和AFLP 等[9-10]，其中SCoT 標記是根據基因組中ATG 翻譯起始位點的側翼有一段短的保守序列的原理進行引物設計，是一種通過單引物擴增目的基因的功能性分子標記[11]，正是因為這一原理，其與許多功能基因能夠形成較多的引物結合位點，擴增的序列介于外顯子與內含子之間，大幅度提升了引物的多態性。SCoT 與其他分子標記手段相比，SCoT 標記技術與供試材料的功能基因密切相關，更能反映相關功能性狀的多態性，且所用引物簡單、通用性強、擴增的條帶穩定且多態性高，擴增產物能夠通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，操作簡單方便、成本低，已經廣泛應用在植物的遺傳多樣性、親緣關系研究、種質資源鑒定與指紋圖譜的構建等方面的研究中[10]。目前，SCoT 分子標記已經成功應用于龍眼[12]、芥菜[13]、葡萄[14]、葛根[15]、鐵皮石斛[16]等植物的遺傳多樣性研究。

筆者以24 份不同來源地的野生赤蒼藤種質為材料，通過正交試驗設計方法建立并優化赤蒼藤SCoT-PCR 反應體系，從SCoT 引物中篩選出穩定性好、多態性高、條帶清晰的引物，為赤蒼藤SCoT分子標記的應用研究奠定基礎，同時也為今后赤蒼藤種質資源評價、遺傳多樣性分析以及種質資源鑒定等方面的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2022 年4 月在廣西壯族自治區農業科學院科研實驗樓進行，試驗材料為隨機抽取的24份不同來源地的野生赤蒼藤種質（表1），進行PCR體系優化與引物篩選，引物采用Collard 和Mackill公布的SCoT 分子標記引物SCoT-1～SCoT-36[11]，由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 24 份赤蒼藤種質編號及來源地

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 的提取與檢測 采用Biospin

全能型植物基因組DNA 提取試劑盒（BSC13S1B，杭州博日科技股份有限公司）提取不同來源地的赤蒼藤葉片的DNA，使用超微量紫外分光光度計測定DNA 濃度和純度，通過1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，提取的赤蒼藤DNA 在-20 ℃冰箱冷凍保存。

1.2.2 SCoT-PCR 反應體系優化 使用預擴增效果較好的SCoT-1 引物、Es 24 赤蒼藤DNA 模板，對SCoT-PCR 反應體系中DNA 模板量、引物、2×EsTaqMaster Mix（CW0690M，康為世紀生物科技股份有限公司）3 個影響因素進行優化，每個因素設置3個水平，采用L9（33）正交試驗（表2），每個處理2 次重復。PCR 擴增程序設置為：94 ℃2 min 預變性；94 ℃30 s 變性，57 ℃30 s 復性，72 ℃30 s 延伸，35次循環；72 ℃5 min 總延伸；反應體系為20 μL，DNA 模板、引物、2×EsTaqMaster Mix 用量按正交試驗表添加，剩余用ddH2O 補足，PCR 反應結束后使用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測擴增產物，拍照分析各反應條件的擴增效果。正交試驗結果通過直觀分析法[17]進行分析，根據擴增條帶數量、清晰程度等進行評分，滿分為9 分，分值越高代表擴增效果越好。計算每個因素不同水平下的評分平均值Ki，并求出同一因素不同水平間的評分平均值的極差R，R值越大表示影響程度越大，最終篩選出最適合的反應條件。

表2 正交試驗因素及水平

1.2.3 引物初篩和退火溫度篩選 以Es24 赤蒼藤DNA 為模板，SCoT-1～SCoT-36 為引物，使用優化后的SCoT-PCR 反應體系進行初步篩選，并對初篩結果中擴增條帶不清晰的引物設置退火溫度梯度（48、51、53、57、60、63 ℃）進行復篩。挑選2 輪篩選中條帶清晰，多態性高的引物用于SCoT-PCR 反應體系驗證。

1.2.4 SCoT-PCR 反應體系驗證 從篩選到的條帶清晰、多態性高的引物中隨機挑選3 個引物對24份赤蒼藤DNA 模板驗證篩選出的最佳反應體系，用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測結果。

1.3 數據處理

使用SPSS 22.0 生成三因素三水平正交試驗表，通過Excel 2016 計算平均值Ki和極差R。

2 結果與分析

2.1 SCoT-PCR反應體系優化結果

通過PCR 擴增結果（圖1）看出不同的正交組合擴增的條帶有較大差異，條帶數量，清晰程度均有不同，其中處理8 的擴增效果最好，評分結果如表3 所示，通過R值判斷3 個因素對赤蒼藤SCoT-PCR 反應體系的影響程度排序為：DNA 模板量＞引物用量＞Mix 混合液用量，通過Ki值確定最優反應體系（20.0 μL）為1.0 μL DNA 模板（50 ng·μL-1）、1.2 μL 引物（10 μmoL·μL-1）、10.0 μL Mix 混合液和7.8 μL ddH2O。

圖1 SCoT-PCR 正交試驗電泳檢測結果

表3 正交試驗組合及評分

2.2 引物初篩與退火溫度篩選結果

通過對SCoT-1～SCoT-36 引物的初步篩選以及部分引物退火溫度的復篩，由圖2 可知，不同退火溫度對PCR 擴增的結果影響較大，退火溫度越高，擴增的條帶越少，不同引物的最適退火溫度也不相同。以背景清晰、條帶明亮、數量多的擴增結果確定最佳退火溫度，淘汰各個退火溫度下擴增效果均不太好的引物，最終確定表4 引物和退火溫度適用于赤蒼藤材料的SCoT-PCR 反應。

圖2 部分引物的退火溫度篩選電泳檢測結果

2.3 SCoT-PCR反應體系驗證結果

在篩選出的SCoT 引物中隨機挑選了SCoT-2、SCoT-11、SCoT-22 引物進行SCoT-PCR 反應體系驗證（表4），以24 份不同來源地的赤蒼藤材料DNA為模板，隨機挑選的3 條引物均能擴增出背景清晰、多態性豐富的條帶（圖3），不同來源地的赤蒼藤的擴增條帶能夠體現出差異，其中SCoT-2 共擴增11個位點，多態性位點11 個；SCoT-11 共擴增10 個位點，多態性位點6 個；SCoT-22 共擴增11 個位點，多態性位點9 個。結果表明，該SCoT-PCR 反應體系穩定可靠，可用于赤蒼藤的SCoT 分子標記。

表4 適用于赤蒼藤SCoT 分子標記的引物最適退火溫度

圖3 SCoT-2、SCoT-11、SCoT-22 引物對24 份赤蒼藤材料的SCoT-PCR 電泳檢測結果

3 討論與結論

SCoT 分子標記是一種與目的基因緊密關聯的分子標記方法，它利用基因組中ATG 翻譯起始位點側翼的序列具有較高的保守性和一致性的原理，能夠擴增相關功能基因，獲得與性狀緊密聯系的分子標記[10-11]。準確、有效地應用SCoT 分子標記技術需要建立一個穩定可靠的SCoT-PCR 反應體系，而SCoT-PCR 反應受多個因素的影響，且不同材料的SCoT-PCR 反應體系的各因素對體系的影響是不同的[16，18-19]，因此需要通過正交試驗優化研究材料的PCR 反應體系。通常SCoT 標記的反應體系中影響的因素為Mg2+、模板DNA、引物、DNA 聚合酶、dNTPs 等。尚小紅等[20]、孫成成等[21]的研究通過對這5 個因素進行正交試驗來完成SCoT-PCR 反應體系的優化，隨著PCR Mix 混合液的應用，在PCR反應體系中5 個因素變為3 個因素，減少了試劑的添加步驟，使PCR 結果更為穩定可靠，重復性更好[22]。筆者試驗使用的2×EsTaqMaster Mix 中含有Mg2+、dNTPs、DNA 聚合酶，這些因素會影響PCR擴增結果，也需要通過設置梯度探索適用于赤蒼藤的反應條件。邵征績等[16]、婁永峰等[23]通過Mix 混合液、模板DNA、引物3 個因素進行正交試驗獲得了鐵皮石斛和陳山紅心杉SCoT-PCR 的最優反應體系。筆者通過三因素三水平正交試驗優化SCoT-PCR 反應體系，結果表明，3 個因素對赤蒼藤SCoT-PCR 反應體系的影響程度排序為：DNA 模板量＞引物用量＞Mix 混合液用量，與黃曉慧等[24]的中國蘭的體系優化研究結果一致，但與鐵皮石斛[16]、沙棘[18]、陳山紅心杉[23]的研究結果有所差異，說明反應體系的影響因素因植物材料的不同，結果表現也不相同。

在PCR 反應條件中，退火溫度也是重要的影響因素，溫度過高會致使引物與DNA 模板結合差、多態性低、條帶少，而溫度過低則會導致引物與DNA模板的非特異性結合，影響試驗結果[25]。因此，筆者通過對SCoT 引物設置退火溫度梯度篩選，進一步優化SCoT-PCR 反應條件，確定了該反應體系下引物的最適退火溫度，使結果更為準確可靠，有利于后續相關研究工作的開展。

筆者采用正交試驗篩選出SCoT-PCR 反應影響因素的最佳條件，并利用該反應體系篩選出適用于赤蒼藤的SCoT 標記引物，再通過不同地理位置分布的赤蒼藤種質材料對該反應體系進行驗證，最終確立赤蒼藤SCoT-PCR 最優反應體系為1.0 μL DNA 模板（50 ng·μL-1）、1.2 μL 引物（10 μmol·μL-1）、10.0 μL Mix 混合液和7.8 μL ddH2O。筆者共篩選了SCoT-1、SCoT-2 等14 條引物，確定了該反應體系下14 條引物的最適退火溫度，為后續開展赤蒼藤種質資源收集與保護、遺傳多樣性研究和分子育種提供參考依據。