基于Wnt/β-catenin 信號通路的中醫(yī)藥防治骨質(zhì)疏松癥研究進展*

金穎慧，閆國強，張俊艷，張 倩，李寶芬

（河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，河北 滄州 061000）

骨質(zhì)疏松癥為全身慢性代謝性疾病，主要特征是骨密度降低、骨微結(jié)構(gòu)破壞，造成骨脆性增加［1］，易導致骨折。其嚴重的不良反應事件為發(fā)生脆性骨折，較輕的碰撞、跌倒，甚至咳嗽均可能導致骨折發(fā)生，威脅老年人的身體健康。骨密度受一系列細胞因子、信號通路的影響和控制。骨代謝過程中的信號傳遞調(diào)控機制的障礙為誘導骨質(zhì)疏松癥關(guān)鍵因素，對于Wnt信號通路影響骨代謝調(diào)節(jié)機制的研究日益增多，該通路分為經(jīng)典與非經(jīng)典兩類，目前僅對前者的研究較多。中醫(yī)藥防治骨質(zhì)疏松癥日益受到重視，并突顯出巨大優(yōu)勢。在此，以“Wnt/β-catenin 信號通路”“骨質(zhì)疏松癥”“中醫(yī)藥”為關(guān)鍵詞，檢索國內(nèi)外數(shù)據(jù)庫中相關(guān)文獻，總結(jié)Wnt/βcatenin 信號通路對骨質(zhì)疏松癥的影響及中醫(yī)藥防治骨質(zhì)疏松癥的研究進展。現(xiàn)報道如下。

1 發(fā)病機制

骨質(zhì)疏松癥主要發(fā)病機制為骨代謝失衡，即骨吸收大于形成，其以破骨細胞活動占優(yōu)勢或成骨細胞活動不足、成骨性刺激不夠等為主要致病因素［2-3］。骨系統(tǒng)平衡一旦被打破，會導致骨量減少、骨密度下降，引發(fā)骨質(zhì)疏松。骨重建可維持骨代謝平衡，該過程包括激活、骨吸收、偶聯(lián)、骨形成、休止5 個階段［4］。成骨細胞（骨形成細胞）和破骨細胞（骨吸收細胞）在骨重建過程中起主要作用，其可成為治療骨質(zhì)疏松癥的著手點。

2 Wnt/β-catenin 通路與疾病的關(guān)系

Wnt/ β -catenin 信號通路在調(diào)控細胞的增殖、分化、凋亡、存活及癌變等過程中起重要作用，這可能與其參與骨代謝有關(guān)［5］。Wnt/ β -catenin 通路主要由細胞外Wnt 配體蛋白（Wnt1、Wnt3、Wnt3a、Wnt7b、Wnt8等）、細胞膜上的受體［Frizzled 家族分子和低密度脂蛋白受體5/ 6（LRP5/ 6）］、細胞質(zhì)內(nèi)的信號傳導蛋白［β 聯(lián)蛋白（β -catenin）、Dsh 蛋白（Dsh）、APC 蛋白（APC）、軸蛋白（Axin）、糖原合成激酶3β（GSK -3β）等］以及細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子［T 細胞因子/ 淋巴增強因子（TCF/ LEF）］等幾部分組成［5］。有研究表明，Wnt 信號通路可通過調(diào)控成骨細胞及破骨細胞，引發(fā)骨改建，影響骨形成和骨代謝，進而改善骨質(zhì)疏松癥程度［6-8］。

成骨細胞是由成骨細胞前體衍生而來的單核細胞單位。它負責制造骨的主要蛋白和骨鈣素、骨橋蛋白等Ⅰ型膠原蛋白，構(gòu)成骨的有機環(huán)境；還負責骨礦化和制造酶堿性磷酸鹽。研究顯示，成骨細胞在控制破骨細胞形成中起重要作用［9］。骨細胞為另一種類型骨組織的細胞，主要源于成骨細胞中骨髓間充質(zhì)干細胞（BM-MSCs）分化，也參與骨的維持和礦化。許多不同骨骼疾病的治療方法均通過骨細胞發(fā)揮作用。激活Wnt/ β -catenin信號通路可促進成骨細胞的增殖，且可調(diào)節(jié)成骨細胞分化的各個時期，例如Wnt3a 可通過Wnt/ β -catenin信號通路，促進BM-MSCs 向成骨細胞分化，并且在成骨誘導的早期刺激效果最明顯，在成骨誘導的后期，Wnt3a對成骨誘導效果明顯減弱［10］。當BM-MSCs開始向成骨方向分化時，Wnt信號通路可促使干細胞向成骨分化，即細胞形態(tài)由梭形轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切危?1］。而Wnt信號通路的拮抗分子，如分泌型卷曲相關(guān)蛋白（SFRP）、通路抑制劑Dickkopf -1（DKK1）等在成骨細胞分化后期表達量明顯增加，可阻止Wnt 蛋白的下行傳導，阻礙成骨細胞的活動，進而抑制成骨；反之，拮抗分子的失活則可導致高骨密度癥［12］。LRP5 在骨代謝中起重要作用，作為Wnt受體和β-catenin 的上游基因，其激活可導致骨量增高，失活則可導致骨量減少，進而誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥［13］。β -catenin 為Wnt 信號通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在細胞信號傳導過程中起重要作用，當激活Wnt信號通路時，β -catenin 通過與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子（TCF/ LEF）DNA結(jié)合，改變DNA 結(jié)構(gòu)啟動下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進成骨細胞的分化、增殖；β -catenin 的缺失可使成骨細胞的數(shù)量減少，破骨細胞數(shù)量增加，從而影響骨的生理功能，導致骨質(zhì)疏松［14］。Wnt信號通路中的GSK-3β具有雙向作用，其通過磷酸化β-catenin促進其降解進而減少其含量，抑制成骨細胞的分化增殖；同時GSK-3β可與Axin 向細胞膜移動并結(jié)合配體，磷酸化LRP5/ 6 并形成的大量蛋白質(zhì)體可阻斷GSK3β，促進β-catenin活動。GSK -3β 抑制劑可通過誘導成骨細胞分化及促進骨形成增加骨密度［15］。研究表明，Wnt 可直接影響前體細胞向成骨細胞分化的總過程，當成骨細胞外Wnt蛋白與細胞膜上受體LRP5/LRP6 結(jié)合后，通過與細胞質(zhì)內(nèi)的Dsh、GSK-3β，Axin，DKKs 等相互作用形成二聚體，升高β -catenin 水平，進而進入細胞核內(nèi)，通過TCF/LEF1 影響Runx2 及Osterix 的表達，促進成骨細胞的增殖與分化［16-19］。

Wnt/β-catenin 信號通路激活后可調(diào)控破骨細胞的表達，對其生成、分化過程具有重要的影響［20-21］。破骨細胞是由骨髓巨噬細胞在關(guān)鍵細胞因子、巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）、核因子（NF-κB）配體受體激活因子（RANKL）的存在下產(chǎn)生的［22］，為致死性分化的髓樣多核破骨細胞前體，其轉(zhuǎn)化可消除礦化骨環(huán)境。破骨細胞前體在血液中流動，由這些前體的合成產(chǎn)生骨髓和成體破骨細胞。在骨吸收過程中，破骨細胞附著于骨，并在其細胞質(zhì)的大致圓形延伸中與骨基質(zhì)形成密封，在這些密封區(qū)域內(nèi)，破骨細胞形成皺褶的邊界膜。這種封閉和分泌意味著骨基質(zhì)降解，骨礦物質(zhì)溶解，可保護鄰近細胞免受鹽酸傷害。Wnt/ β -catenin 信號通路主要的配體Wnt3a 與破骨細胞具有密切關(guān)系。Wnt3a通過與破骨細胞表面的卷曲蛋白（Frz）和LRP5/ LRP6復合物結(jié)合，激活Wnt 信號通路，促進細胞內(nèi)的Axin-APC -GSK -3β 復合體形成，導致GSK -3β 無法磷酸化β -catenin，當后者在破骨細胞內(nèi)聚集到一定濃度后，就會進入細胞核內(nèi)，啟動基因轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮作用［23］，在任何狀態(tài)下，破骨細胞中β-catenin的失活均能增加破骨細胞的數(shù)量和骨吸收，導致骨量減少［24］。成骨細胞內(nèi)Wnt信號改變會引起其分化，一小部分可能由破骨細胞功能改變或RANKL 信號通路改變引起［23］。而成骨細胞或其他細胞產(chǎn)生的Wnts 也會影響破骨細胞功能。如成骨細胞來源的Wnt5a 可增強破骨細胞分化［25］。但有相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)，人體即便在缺少骨保護素（OPG）的條件下，Wnt系統(tǒng)依然具有骨保護的作用［24］。

3 中醫(yī)病解及中藥點評

3.1 中醫(yī)病解

骨質(zhì)疏松癥屬中醫(yī)“骨痿”“骨痹”“骨枯”“骨極”范疇。古文中也有“歷節(jié)”“骨肉疏薄”等相似記載［26］。中醫(yī)理論認為，腎為先天之本，主骨，滋養(yǎng)骨骼，《素問·六節(jié)臟象論》曰“腎者……封藏之本……其充在骨”，腎精充足骨髓得養(yǎng)，腎精不足則骨痿無力?！鹅`樞·本臟》有論述“經(jīng)脈者，所以行血氣而營陰陽，濡筋骨，利關(guān)節(jié)者也”，瘀血阻滯，氣血不能濡養(yǎng)骨骼，則關(guān)節(jié)不利。骨質(zhì)疏松癥病位雖在骨骼，但存在臟腑失調(diào)，腎臟及脾胃功能失司，病因病機有虛有實，多以虛為主，氣虛及腎氣不足為根本，脾胃虛損、脈絡瘀阻是發(fā)病的重要因素。相關(guān)文獻表明，腎虛是原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展的重要病機。而補益藥可改善患者的腎陰虛、腎陽虛癥狀，有補氣血陰陽功效，以助患者補陽滋陰，調(diào)和氣血，益氣健脾［27］。

3.2 中藥點評

近年來，許多經(jīng)典中藥方，如左歸丸［28］、益骨湯［29］、壯骨止痛方［30］等均被證實具有上調(diào)Wnt/ β -catenin 通路表達、促進BMSCs 成骨分化、增加骨密度的作用。中藥復方［31］組成以滋補肝腎類淫羊藿、補骨脂、骨碎補等為主，配以熟地黃、白芍等補血藥，或黃芪等補氣藥等加減而成。大部分上述中藥被證實可通過調(diào)控Wnt 信號通路或下游靶基因表達促進骨形成和骨礦化，故挑選其中應用頻率較高的5種總結(jié)如下。

熟地黃：性溫，味甘，功效長于補?！侗静菥V目》中記載熟地黃“填骨髓，長肌肉，生精血，補五臟、內(nèi)傷不足”。現(xiàn)代藥理學研究表明，熟地黃含梓醇、地黃苷（A，B，D 等）、地黃素、氨基酸、糖類等成分，具有抗氧化、抗癌、抗衰老、影響骨代謝等作用［32-33］。熟地黃可促進骨形成，抑制骨破壞，延緩骨量丟失，促進骨系統(tǒng)平衡，進而防治骨質(zhì)疏松癥。臨床研究發(fā)現(xiàn)六味地黃丸聯(lián)合唑來膦酸治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，可通過降低血清中Ⅰ型原膠原氨基端前肽（PINP）、β-膠原降解產(chǎn)物（β-CTX）、堿性磷酸酶（ALP）及骨鈣素（BGP）的水平，進而使腰椎1-4、全髖關(guān)節(jié)骨和左側(cè)股骨頸部位的骨密度增加，緩解患者的骨質(zhì)疏松癥癥狀［34］。另有研究表明，右歸丸聯(lián)合阿侖膦酸鈉治療腎陽虛證型的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，可在一定程度上改善骨密度并緩解患者因骨質(zhì)疏松癥導致的腰背部疼痛，緩解其疲勞癥狀［35］。熟地黃在中藥復方中多作為君藥發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用。研究發(fā)現(xiàn)，地黃水提物治療去卵巢骨質(zhì)疏松癥模型大鼠8周后，實驗大鼠的股骨及腰椎骨密度均顯著增加，且不影響其雌激素水平［36］。歐莉等［37］研究表明，熟地黃配伍黃芪能明顯升高Wnt2、LRP5 及β -catenin mRNA 的表達水平，說明熟地黃-黃芪可能通過激活Wnt/ LRP/ β -catenin 信號通路，抑制β -catenin的降解，使β -catenin 穩(wěn)定積聚于細胞質(zhì)中，進而促進成骨細胞的增殖分化，調(diào)節(jié)骨代謝。

淫羊藿：性溫，味辛、甘，長于壯腎陽?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》云：“淫羊藿主陰痿絕傷，益氣力，強志。”《本草綱目》指出，淫羊藿具有“強心力、堅筋骨、益精氣、實腰膝”功效。研究表明，淫羊藿具有雌激素樣作用，無毒副作用，口服后產(chǎn)生的活性代謝產(chǎn)物能直接刺激BM-MSCs的增殖，并誘導其向成骨細胞方向分化，從而改善骨質(zhì)疏松［38-40］。臨床運用淫羊藿總黃酮治療老年骨質(zhì)疏松性橈骨遠端骨折，可有效縮短骨折愈合時間，促進腕關(guān)節(jié)功能恢復，改善骨質(zhì)疏松效果明顯［41］。且淫羊藿可有效增加患者的骨密度，緩解腰背疼痛程度，對骨質(zhì)疏松癥療效確切［42］。淫羊藿總黃酮為淫羊藿的主要有效成分，具有提高BM -MSCs 向成骨分化的能力以及抑制破骨細胞活性和破骨細胞生成的雙重活性，可防治骨質(zhì)疏松癥［43-45］；淫羊藿素對大鼠BM-MSCs 的增殖效果具有濃度依賴性［46］；淫羊藿苷通過ERα -Wnt/ β -catenin 通路促進BMSCs 向成骨分化，促進骨生成，并可利用ERα 相關(guān)的OPG/RANKL/RANK 系統(tǒng)，抑制破骨細胞生成，進而抑制骨吸收［47］。李磊等［48］研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷可誘導MSCs 向成骨細胞分化，也可通過促進Wnt3a相關(guān)基因和蛋白的表達促進MSCs向成骨細胞分化。還發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷能提高ALP 活性，促進鈣化結(jié)節(jié)的形成，從而促進BMSCs 向成骨細胞分化。進一步研究表明，淫羊藿可明顯上調(diào)成骨分化基因（Runx2，osteopotin，DLX5，osteocalcin，collagen type I，ERα）以及Wnt信號通路相關(guān)基因（β-catenin，Lef1，TCF7，c-jun，c-myc，cyclin D）的表達，但該促進作用可被Wnt/β-catenin信號通路的抑制劑DKK1抑制［49］。可見，淫羊藿可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路防治骨質(zhì)疏松癥。

黃芪：味甘，性微溫，歸脾、肺二經(jīng)，補益力較強，且有直接補腎氣的作用，《本草綱目》第十二卷草部一中記載“黃芪，氣味甘，微溫，無毒。主治補虛，小兒百病，又補丈夫虛損，五勞羸瘦，益氣，利陰氣。主虛喘，腎衰耳聾”［50］?！稖罕静荨分兄赋?，黃芪“治傷寒尺脈不至，又補腎臟元氣，為里藥，是上中下內(nèi)外三焦之藥”，明確其“補腎臟元氣”［51］。《日華子本草》中記載黃芪具有“助氣，壯筋骨”功效［52］。臨床運用黃芪可很好地緩解患者的腰腿疼痛、麻木無力等骨質(zhì)疏松癥狀，其組方能抑制破骨細胞，減輕骨丟失程度，從而發(fā)揮抑制骨組織的吸收和增加骨量的作用［53］。黃芪主成分為黃酮類、黃芪多糖，其具有提升免疫力、抗病毒、抗菌、保護心腦血管的重要作用，且在治療骨質(zhì)疏松癥方面療效明顯。黃芪多糖可通過促進成骨細胞MC-3T3-E1的增殖發(fā)揮防治骨質(zhì)疏松癥的作用［54］。黃芪可提高性激素水平及胃腸消化與吸收功能，并可促進鈣、磷、鎂等眾多微量元素的吸收，促使骨量增多及骨密度升高［55］。此外，骨質(zhì)疏松癥以黃芪治療，患者腰椎和股骨骨密度值會隨治療時間延長而顯著升高，腎虛癥的評分呈明顯下降趨勢，癥狀改善明顯。大量研究證實，黃芪及其復方是通過Wnt/β -catenin 信號通路促進成骨細胞的增殖、礦化和表達，從而發(fā)揮防治骨質(zhì)疏松癥的作用。黃芪甲苷通過調(diào)節(jié)FoxO3a/ Wnt2/ β -catenin 通路，升高β -catenin 和Wnt2 蛋白表達水平，抑制FoxO3a 蛋白表達水平，可有效緩解氧化應激介導的去卵巢大鼠的骨質(zhì)疏松癥［56］。歐莉等［57］研究發(fā)現(xiàn)，黃芪注射液聯(lián)合摩擦步訓練可降低絕經(jīng)期骨質(zhì)疏松癥患者血清ALP，BGP 含量及血清中白細胞介素（IL）-8、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量，升高IL-10及骨密度，對絕經(jīng)期骨質(zhì)疏松癥療效確切。

骨碎補：味苦，性溫，歸肝、腎經(jīng)，有堅腎、補腎強骨功效。骨碎補始載于《本草拾遺》，清朝《本草述》中記載骨碎補“可治腰痛行痹”。骨碎補可抑制骨吸收相關(guān)的OPG/RANKL/RANK 通路、CTSK信號通路中的調(diào)控蛋白，或促進與骨形成相關(guān)的Wnt/ β -catenin 通路和BMP 通路中調(diào)控蛋白的合成和釋放，改善骨代謝不平衡，從而防治骨質(zhì)疏松癥。骨碎補抗骨質(zhì)疏松癥的主成分為總黃酮，其活性單體成分含量較高的為柚皮苷及新北美圣草苷。實驗研究發(fā)現(xiàn)，骨碎補總黃酮促進BMSCs 成骨分化早期β -catenin、LEF -1、cycline D 的mRNA 表達，抑制BMSCs 成骨分化晚期β -catenin、LEF -1、cycline D 的mRNA 表達，表明此過程中Wnt/β -catenin 信號通路可能主要參與BMSCs 成骨早期分化［58］。柚皮苷可通過Wnt/β-catenin 信號通路抑制人脂肪源性間充質(zhì)干細胞（hADMSCs）因氧化反應導致的成骨分化［59］。研究發(fā)現(xiàn)，柚皮苷可通過調(diào)節(jié)Akt 和AMPK 激活β -catenin，促進β -catenin 的mRNA 和蛋白表達，并促進UMR-106 細胞中β-catenin 的Ser552磷酸化，進而激活LEF，TCF 轉(zhuǎn)錄因子，說明柚皮苷可通過影響Wnt/β-catenin 信號通路促進去卵巢骨質(zhì)疏松癥模型小鼠成骨細胞的形成［60］。另有研究報道，柚皮苷能有效地抗去卵巢骨質(zhì)疏松癥，促進BMSCs 的增殖和分化，增加BGP 的表達，并增加骨密度、增大骨體積和小梁厚度，可有效逆轉(zhuǎn)卵巢切除術(shù)引起的大鼠骨質(zhì)疏松癥［61］。但有研究表明，骨碎補中另一抗骨質(zhì)疏松癥的活性成分新北美圣草苷在MC3T3-E1細胞增殖和成骨分化方面優(yōu)于柚皮苷，其可促進ALP 活性及上調(diào)Runx2、COLI 和OCN 的表達，可成為治療骨質(zhì)疏松癥的候選藥物［62］。目前，新北美圣草苷抗骨質(zhì)疏松癥的研究尚少，柚皮苷抗骨質(zhì)疏松癥實驗多限于去勢骨質(zhì)疏松癥模型，表明骨碎補抗骨質(zhì)疏松癥的活性成分還需進一步研究。

補骨脂：味辛、苦、性溫，入脾、腎二經(jīng)，補腎陽，固腎氣。《本草經(jīng)疏》云“補骨脂，能暖水土…壯火益土之要藥也”?！端幮哉摗酚涊d其能“治男子腰痛、膝冷…腹中冷”。《惠民和劑局方》中記載“補骨脂丸主治腎虛陽痿證”。研究表明，補骨脂主要成分補骨脂素可促進成骨細胞分化成熟，并可調(diào)控免疫功能，抑制破骨細胞分化及骨吸收［63］。治療骨質(zhì)疏松常用臨床組方中常含補骨脂，可補腎助陽，強筋健骨，增加骨密度［64］。如以青娥丸（補骨脂、杜仲、胡桃、蒜）連續(xù)治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松6個月，發(fā)現(xiàn)其可能通過下調(diào)DKK1 的表達及增加β -catenin 蛋白表達水平，提高Wnt/ β -catenin 信號通路活性，進而促進成骨細胞的骨形成，從而增加骨密度［65］。DKK1 作為阻斷Wnt/ β -catenin 信號通路的抑制劑，可使Wnt3a、LRP5和下游的β-catenin顯著降低，使用較高濃度的補骨脂酚或補骨脂二氫黃酮處理后，Wnt3a，LRP5 和β -catenin 的表達顯著升高，且呈劑量依賴性，補骨脂酚和補骨脂二氫黃酮具有雌激素樣作用，促進成骨細胞分化［66］，表明補骨脂酚和補骨脂二氫黃酮可能通過上調(diào)Wnt/β-catenin 信號通路來誘導成骨細胞的分化。

4 小結(jié)與展望

目前臨床治療骨質(zhì)疏松癥的主要藥物有雌激素類、降鈣素、雙膦酸鹽類、鈣劑和維生素類、甲狀旁腺激素、鍶鹽、雷諾昔芬、氟化物及硬化蛋白抗體等，可通過抑制破骨細胞的破骨作用，促進成骨細胞的成骨作用，達到骨代謝正平衡，治療骨質(zhì)疏松，但長期使用有一定風險，故臨床應用受限制［67］。傳統(tǒng)中醫(yī)學采用整體觀，辨證論治療，如《中國老年骨質(zhì)疏松癥診療指南》中推薦的龍牡壯骨顆粒、仙靈骨葆膠囊和強骨膠囊等，治療骨質(zhì)疏松均有一定效果。查閱中醫(yī)藥防治骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)文獻資料，發(fā)現(xiàn)熟地黃、淫羊藿、黃芪、骨碎補、補骨脂等均可通過調(diào)控Wnt/β-catenin 等信號通路促進成骨細胞分化，促進骨形成，增加骨密度。目前正處于臨床研究中的新藥DKK1抗體，可通過阻止溶骨性病變來治療骨質(zhì)疏松，增加骨形成［68］。而研究已表明補骨脂可降低DKK1 的表達及增加β -catenin 蛋白表達水平，提高Wnt/β-catenin 信號通路活性，進而促進成骨細胞的骨形成，從而增加骨密度［69］。目前臨床用于治療骨質(zhì)疏松癥的藥物種類繁多，尚未發(fā)現(xiàn)可根治此類疾病的特效藥物，篩選防治骨質(zhì)疏松癥的安全有效藥物迫在眉睫。為此，深入對中醫(yī)藥防治骨質(zhì)疏松癥的研究，可為開發(fā)出治療骨質(zhì)疏松癥的中藥特效藥提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。