調臟舒秘合劑質量標準研究*

徐 偉，鐘佰明，王靖雯，范潤勇，周 茜，張 明△

（1.四川省南充市中醫醫院中藥制劑中心，四川 南充 637000；2.四川省南充市食品藥品檢驗所，四川 南充 637000）

調臟舒秘方由柏子仁、白芍、肉蓯蓉、瓜蔞子、白術、當歸、瓜蔞皮、甘草等組方，有調臟利腑、理氣和血、潤腸通便功效，臨床主要用于臟腑功能失調及胃腸功能紊亂引起的腹脹，腹痛，糞便干結、量少，排便困難等，療效確切［1-2］。該方改善模型大鼠慢傳輸型便秘效果明顯，可增加結腸壁卡哈爾間質細胞數量及血清中腸道興奮性遞質濃度［3］，升高膠質細胞源性神經營養因子和微管相關蛋白2 的表達水平，修復結腸神經叢功能，從而達到治療目的［4］。該方常以湯劑用于臨床，但湯劑存在煎煮煩瑣、不便攜帶與儲存、患者依從性差等問題。為此，本研究團隊在不改變原有湯劑成分的前提下將其開發為合劑，為有效控制其質量，擬采用薄層色譜（TLC）法對制劑中的白芍、瓜蔞子、當歸等藥材進行定性鑒別，高效液相色譜（HPLC）法對其中松果菊苷、芍藥苷、阿魏酸含量進行測定，以建立該制劑的質量標準。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ultimate 3000 型高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；AUW220D 型分析天平（日本Shimadzu公司）；TU-1901型雙光束紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；FA2004 型分析天平（上海力辰科技儀器有限公司）；G-100S型超聲波清洗器（深圳市哥能清洗設備有限公司）；RE-1102型旋轉蒸發儀（上海嘉鵬科技有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循環水真空泵（上海力辰科技儀器有限公司）；SYG-4型數顯恒溫水浴鍋（常州朗越儀器制造有限公司）；WGL-45B型電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；LCK2000 型煎藥機（天津三延精密機械有限公司）。

1.2 試藥

調臟舒秘合劑（南充市中醫醫院中藥制劑中心，批號分別為211201，211202，211203）；當歸對照藥材、瓜蔞子對照藥材、白芍對照藥材，松果菊苷對照品（含量91.8%）、芍藥苷對照品（含量96.8%）、阿魏酸對照品（含量99.4%），均購自中國食品藥品檢定研究院（批號分別為120927 -201617，121184 -201605，120905 -201610，111670 -201907，110736 -202044，110773 -201915）；肉蓯蓉飲片（四川景程中藥飲片有限責任公司，批號為 200201；四川欣福源藥業有限公司，批號為C453 210601；成都吉安康藥業有限公司，批號為201201）；白芍飲片（四川和順康藥業有限公司，批號為 211008；四川香雪制藥有限公司，批號為2106 020142；成都吉安康藥業有限公司，批號為200501）；當歸飲片（四川香雪制藥有限公司，批號為C202011001F；四川欣福源藥業有限公司，批號為C157 211001；成都吉安康藥業有限公司，批號為211010-11）；瓜蔞子飲片（成都吉安康藥業有限公司，批號分別為191201，191202，191203）；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為怡寶純凈水。

2 方法與結果

2.1 TLC 鑒別

當歸：取樣品25 mL，加乙酸乙酯萃取3次，每次20 mL，合并有機相，蒸干，殘渣加甲醇2 mL 溶解，即得供試品溶液。取當歸對照藥材0.5 g，加乙酸乙酯20 mL，超聲（功率250 W，頻率40 kHz，下同）處理10 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL 使溶解，即得對照藥材溶液。按調臟舒秘合劑的處方及工藝制備缺當歸的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法［5］，吸取上述溶液各2～5 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（30～60 ℃）-乙酸乙酯（10∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色熒光斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖1 A。

瓜蔞子：供試品溶液制備方法同當歸項。取瓜蔞子對照藥材1.0 g，加乙酸乙酯10 mL，超聲處理10 min，濾過，即得對照藥材溶液。按調臟舒秘合劑的處方及工藝制備缺瓜蔞子的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法［5］，吸取上述溶液各2～5 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（30～60 ℃）-乙酸乙酯（10∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至顯色清晰，置日光燈下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖1 B。

白芍：取樣品25 mL，加乙酸乙酯萃取3次，每次20 mL，取水相，蒸干，加甲醇溶液10 mL，攪拌，超聲處理10 min，濾過，取續濾液，作為供試品溶液。取白芍對照藥材適量，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的對照藥材溶液。按調臟舒秘合劑處方及工藝制備缺白芍的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC 法［5］，吸取上述溶液各10～15 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（8∶1∶3∶0.1，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至顯色清晰，置日光燈下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖1 C。

圖1 薄層色譜圖1.Reference medicinal materials solution 2.Negative reference solution 3-5.Test solutionA.Angelicae Sinensis Radix（365 nm UV lamp）B.Trichosanthis Semen（fluorescent lamp）C.Paeoniae Radix Alba（fluorescent lamp）Fig.1 TLC chromatograms

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB -C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.2%磷酸溶液（20∶80，V/V）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：230 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：5 μL。

2.2.2 溶液制備

取松果菊苷、芍藥苷、阿魏酸對照品各適量，精密稱定，分別加50%甲醇，制成每1 mL 含松果菊苷4 134.0 μg、芍藥苷1 255.2 μg、阿魏酸835.0 μg 的單一對照品溶液；分別精密量取1，10，1 mL，置25 mL容量瓶中，混勻，制成每1 mL含松果菊苷165.36 μg、芍藥苷502.08 μg、阿魏酸33.40 μg的混合對照品溶液。精密量取樣品5 mL，置25 mL容量瓶中，加水定容，4 000 r/min離心15 min，取上清液，經0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。按調臟舒秘合劑處方及工藝分別制備缺肉蓯蓉、白芍、當歸的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得相應陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：精密量取2.2.2 項下混合對照品溶液、供試品溶液及3 種陰性對照品溶液各5 μL，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果供試品溶液在與混合對照品溶液相同保留時間處有相應色譜峰，且陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。詳見圖2。

圖2 高效液相色譜圖1.Echinacoside 2.Paeoniflorin 3.Ferulic acidA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solution lacking Cistanches Herba D.Negative reference solution lacking Paeoniae Radix Alba E.Negative reference solution lacking Angelicae Sinensis RadixFig.2 HPLC chromatograms

線性關系考察：分別精密量取2.2.2項下混合對照品溶液1.00，2.50，3.75，5.00，7.50，10.00 mL，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇定容，制成松果菊苷質量濃度分別為16.54，41.34，62.01，82.68，124.02，165.36 μg/mL，芍藥苷質量濃度分別為50.21，125.52，188.28，251.04，376.56，502.08 μg/mL，阿魏酸質量濃度分別為3.34，8.35，12.53，16.70，25.05，33.40 μg/ mL 的系列混合對照品溶液，取適量，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標、待測成分質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標進行線性回歸。結果見表1。

表1 線性關系考察結果（n=6）Tab.1 Results of the linear relation test（n=6）

精密度試驗：取混合對照品溶液適量，按2.2.1 項下色譜條件連續進樣測定5 次，記錄峰面積。結果松果菊苷、芍藥苷、阿魏酸峰面積的RSD分別為1.16%，0.39%，1.01%（n=5），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，6，12，24 h 時，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果松果菊苷、芍藥苷、阿魏酸峰面積的RSD分別為1.18%，0.70%，1.38%（n=6），表明供試品溶液室溫放置24 h內基本穩定。

重復性試驗：取樣品（批號為211201）適量，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積并計算含量。結果松果菊苷、芍藥苷、阿魏酸的平均含量分別為700.15，1 619.20，24.29 μg/ mL，RSD分別為1.42%，0.52%，1.30%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密量取已知含量樣品適量，置25 mL 容量瓶中，平行6份，分別精密加入2.2.2項下松果菊苷、芍藥苷、阿魏酸對照品溶液400，2 500，150 μL，加水定容，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.2.4 樣品含量測定

取3 批樣品適量，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果（μg/mL，n=3）Tab.3 Results of the content determination of echinacoside，paeoniflorin and ferulic acid in the samples（μg/mL，n=3）

2.2.5 目標成分轉移率

按2020 年版《中國藥典（一部）》方法提取3 批次肉蓯蓉、白芍、當歸藥材中活性成分，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，計算松果菊苷、芍藥苷、阿魏酸的含量及轉移率。轉移率=制劑成分含量/（藥材成分含量×處方藥材加入量）×100%。結果見表4。

表4 目標成分轉移率測定結果（n=3）Tab.4 The test results of the transfer rates of target components（n=3）

3 討論

預試驗中同時對制劑中白芍、肉蓯蓉、瓜蔞子、白術、當歸、瓜蔞皮進行TLC 鑒別，其中肉蓯蓉中的松果菊苷與毛蕊花糖苷存在雜質干擾強、成點性差、重復性差的缺點；白術中的蒼術酮未檢出；瓜蔞皮陰性對照有干擾，故均未納入質量標準。對白芍、瓜蔞子、當歸進行的TLC 鑒別，結果顯示其斑點顯色清晰，陰性對照無干擾，專屬性強，重復性好，操作簡單快捷，可作為制劑有效定性鑒別方法。另外，當歸、瓜蔞子的TLC 鑒別是在藥典方法基礎上將兩者不同的薄層展開系統［正己烷-乙酸乙酯（4∶1，V/V）與環己烷-乙酸乙酯（5∶1，V/V）］更改為相同的石油醚（30～60 ℃）-乙酸乙酯（10∶1，V/V），可在同一硅膠G 薄層板上同時完成兩種藥材的TLC鑒別。

肉蓯蓉可促進家兔離體小腸平滑肌收縮［6］。松果菊苷活性單體可通過上調轉化生長因子（TGF-β1）來促進腸道上皮細胞增殖和抑制細胞死亡，修復腸道黏膜組織［7］。白芍可降低結腸血管活性腸肽及水通道蛋白4的表達水平，增加腸道內水分，降低腸道平滑肌張力，減少糞便下行阻力［8］；可抗膽堿能受體表現出止痛作用［9］。芍藥苷活性單體可改善洛哌丁胺誘導的模型大鼠慢傳輸型便秘［10］；對小鼠內臟具有明顯鎮痛作用［11-13］。當歸水煎液可改善模型小鼠血虛便秘證候，縮短排便時間，增加結腸和糞便含水量［14］。阿魏酸活性單體可抑制熱應激誘導的小鼠腸道損傷，增加腸道屏障功能［15-16］；調節小鼠腸道微生物菌群［17-18］。故本研究中選用肉蓯蓉、白芍、當歸藥材中的活性成分進行含量測定。采用紫外-可見分光光度法，對松果菊苷、芍藥苷、阿魏酸對照品溶液進行全波長掃描，在230 nm 波長附近各對照品溶液均有較強吸收，與文獻［19 -20］的報道一致。考察甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸水3 種流動相系統，結果以乙腈-磷酸水系統分離度好，峰寬小，無拖尾，且可以等度法同時測定3種活性成分。2020 年版《中國藥典（一部）》指出，肉蓯蓉中松果菊苷與毛蕊花糖苷總量不得少于0.30%，白芍中芍藥苷不得少于1.6%，當歸中阿魏酸不得少于0.050%。本研究中，目標成分含量均符合規定。

綜上所述，本研究中建立了調臟舒秘合劑中白芍、瓜蔞子、當歸的TLC 鑒別及主要功效成分松果菊苷、芍藥苷、阿魏酸的含量測定方法，所建方法精密度高，重復性、穩定性好，可用于調臟舒秘合劑的質量控制；同時對上述3種主要功效成分轉移率進行了測定，為其含量限定提供了依據。其中，松果菊苷轉移率偏低，需進一步進行研究。