西帕依固齦液治療糖尿病足潰瘍效果及網絡藥理學分析*

李 茜，郝 夢，李金耀，李建德，劉 婷，季志紅

（1.新奇康藥業股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆大學生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊 830049；3.新疆醫科大學第四附屬醫院，新疆 烏魯木齊 830054；4.新疆奇沐醫藥研究院，新疆 烏魯木齊 830011；5.新疆中藥＜民族藥＞制藥共性關鍵技術研究重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830011）

糖尿病足潰瘍（DFU）為嚴重的慢性糖尿病并發癥，臨床主要表現為伴有神經病變和周圍血管病變的足部潰瘍［1］。DFU 可導致感染、壞疽、截肢，甚至死亡，給患者帶來身體痛苦和經濟負擔。目前主要治療手段為在控制血糖基礎上，清潔護理創面、控制感染、增加血流灌注和足部減壓［2］。中醫將DFU 歸為“脫疽”，多以清熱解毒、祛腐排膿、活血散瘀、消癰止痛為治療原則［3］。西帕依固齦液主要組成藥材為沒食子，具有清熱解毒、化腐消癰、活血逐瘀功效，主要用于治療牙周疾病引起的牙齒酸軟、牙齦出血、口舌生瘡，咽喉腫痛等病癥［4］。本研究中探討了西帕依固齦液促進模型大鼠DFU愈合的效果，并結合網絡藥理學分析其作用機理，為后續研究該制劑治療DFU的藥物效應動力學和機制提供參考，同時為制劑的二次開發探索提供研究基礎?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：PL2002型分析電子天平（梅特勒-托利多儀器＜上海＞有限公司）；EQ2016 -037 型顯微鏡（德國Leica公司）。

試藥：西帕依固齦液（新奇康藥業股份有限公司，批號為191021，規格為每瓶100 mL）；鏈脲佐菌素（STZ，美國西格瑪奧德里奇公司，批號為190209）、檸檬酸、檸檬酸三鈉均為分析純；水為純化水。

動物：SD 大鼠50 只，健康潔凈級，雄性，5～7 周齡，體質量（200±20）g，均購自新疆農業大學，實驗動物生產許可證號SCXK（新）2018 -0002，倫理批件號2019011。所有大鼠均于無特定病原體環境中飼養，溫度（25±2）℃，相對濕度（50±5）%，人工光照12 h/12 h明暗交替，自由進食飲水，適應性喂養1周。

1.2 方法

1.2.1 動物實驗

糖尿病模型建立：適應期結束后即稱定大鼠體質量，并隨機分為空白組（10只）及實驗組（40只）。實驗組采用飲食誘導+化學試劑誘導的方法建模，給予正常飲食、飲水，灌胃高脂乳劑飼料（每100 g體質量0.6 mL），每天1次，持續飼喂30 d，每5 d記錄1次體質量，并觀察大鼠形態變化；30 d后腹腔注射1%STZ溶液（60 mg/ kg），連續注射3 d后，禁食12 h，于次日清晨對實驗組大鼠尾尖部針刺采血，使用血糖儀和試紙測量血糖，連續2 次血糖＞16.7 mmol/L即為糖尿病大鼠模型復制成功。

DFU 模型建立：取糖尿病模型大鼠，對其左踝關節周圍1.5 cm 范圍脫毛，后期用藥階段中每3 d 重復脫毛1 次，用棉簽蘸取飽和氫氧化鈉溶液涂抹于裸露皮膚持續30 s后，用生理鹽水和清水多次反復清洗以建立足部潰瘍模型。涂抹氫氧化鈉時，注意控制涂抹面積大致相當且均勻，建模成功后，記錄大鼠初始潰瘍面積，并每7 d 記錄1 次潰瘍愈合情況。此期間給予所有大鼠正常飲食、飲水，不給予其他處理。

分組及給藥：將實驗組26只DFU模型大鼠隨機分為模型組和給藥組，各13只。模型組大鼠2次血糖平均值分別為（18.4±3.4）mmol/L、（18.3±3.4）mmol/L，給藥組分別為（18.5±3.4）mmol/L、（20.0±3.3）mmol/L。給藥組大鼠潰瘍區域沖洗涂抹西帕依固齦液，每只2 mL，早晚各1次，先徹底沖洗潰瘍面，再用棉簽拭去多余液體。每次給藥后以無菌紗布覆蓋并固定。模型組及空白組大鼠給予等體積生理鹽水。連續給藥14 d。

檢測指標：于治療第1，7，15 天采用計算機像素點法測量潰瘍面積，計算潰瘍面抑制率。潰瘍抑制率（%）=（模型組大鼠潰瘍面積-給藥組大鼠潰瘍面積）/模型組大鼠潰瘍面積×100%。對大鼠腹主動脈采血，取血清，采用酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測表皮生長因子（EGF）水平。取大鼠潰瘍部位組織，固定于10%中性甲醛溶液中，脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、蘇木素-伊紅（HE）染色、封片后，顯微鏡下觀察組織形態并攝片。

統計學處理：采用SPSS 20.0 統計學軟件分析。計量資料以表示，行t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

1.2.2 網絡藥理學

化學成分及靶點獲取：以“沒食子”為檢索詞，在中國知網、萬方醫學網以及Geen Medical 等平臺獲取相關文獻，總結整理沒食子化學成分；將成分導入中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP，https：// tcmspw.com/ tcmsp.php），設置口服生物利用度（OB）≥30%進行篩選。根據現有文獻報道補充沒食子酸乙酯（OB=25.61%），建立西帕依固齦液的成分數據庫；通過TCMSP 獲取成分的靶點，運用Uniprot 數據庫（https：//www.uniprot.org/）下載靶點標準名稱文件，對靶點進行標準化處理，構建西帕依固齦液的靶點數據庫。

疾病靶點獲?。阂浴癉iabetic foot ulcer”為關鍵詞，分別檢索藥物數據庫（DrugBank，https：// go.drugbank.com/）、人類基因組數據庫（GeneCards，https：// www.genecards.org/）、人類孟德爾遺傳數據庫（OMIM，https：// omim.org/）、治療靶點數據庫（TTD，https：//go.drugbank.com/）獲取DFU 相關靶點，去重后構建DFU的靶點數據庫。

交集靶點獲?。豪肦 語言3.6.1 軟件，整理前述2個靶點數據庫文件，獲取二者的交集靶點。

“成分-靶點”網絡構建：將交集靶點、藥物-成分關系、成分-靶點關系相關數據導入Cytoscape 3.8.0軟件，構建“成分-靶點”網絡。成分及靶點的形狀大小反映Degree值大小。

蛋白質相互作用（PPI）網絡構建及分析：利用String數據庫（https：// string -db.org/），選擇“Multiple proteins”，導入交集靶點文件相關數據，物種選擇“Homo sapiens”，參數設置為“最低要求評分0.4分”“刪除游離節點”，獲取PPI 網絡圖。將PPI 網絡關系相關數據導入Cytoscape 3.8.0 軟件，以“Degree centrality，DC”“Closeness centrality，CC”“Betweenness centrality，BC”“Eigenvector centrality，EC”“Network centrality，NC”“localaverage Connectivity，LAC”為篩選條件，選取以上6個拓撲特征值均大于其相應中位數的靶點作為核心靶點，進行2輪分析，構建PPI拓撲分析圖。

富集分析：利用R 語言3.6.1 軟件的“dose bioconductor”“clusterprofiler bioconductor”“enrichplot bioconductor”“pathview bioconductor”包，對交集靶點進行基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析，設定顯著性條件為q.adjust ＜0.05，篩選顯著的生物功能和信號通路，并制作氣泡圖和條形圖。

分子對接驗證：將“成分-靶點”網絡與PPI中Degree值排名前3的成分與靶點進行對接。從PubChem 數據庫（https：// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載配體文件，利用Chem3D 軟件對配體進行能量最小化處理。從蛋白質結構數據庫（PDB，http：//www1.rcsb.org/）中下載受體結構文件，利用PyMOL 對受體進行去水和除雜等處理；通過AutoDockTools 1.5.6軟件確定配體、受體結合的活性口袋相關參數，并進行半柔性分子對接。借助PyMOL繪制最佳對接模型圖。結合能小于0 kcal/mol表明配體能和受體自發結合，結合能越小對接越好。小于-5.0 kcal/mol，表明結合性較好。

2 結果

2.1 動物實驗

大鼠一般情況：大鼠體質量變化情況見表1。實驗期間空白組大鼠體質量持續升高，給藥組和模型組大鼠僅在前期飲食誘導期間升高。在糖尿病模型復制成功后，大鼠皆出現典型的“三多一少”癥狀。且大鼠表觀毛色偏黃，暗淡無光澤，并有精神萎靡表現，其中1只大鼠出現厭食等抑郁相關癥狀。實驗結束后，給藥組大鼠潰瘍面出現修復狀態，潰瘍顏色變淡，且未出現擴大現象；模型組大鼠潰瘍顏色較深，其中個別潰瘍面擴大。

表1 大鼠體質量變化情況（，g）Tab.1 Changes of body mass in rats（，g）

表1 大鼠體質量變化情況（，g）Tab.1 Changes of body mass in rats（，g）

檢測指標：給藥7 d 及15 d 后給藥組大鼠潰瘍面積明顯小于模型組（P＜0.05），見表2。給藥15 d時給藥組大鼠潰瘍抑制率為58.38%。與空白組比較，模型組EGF水平顯著降低［（558.13 ± 87.84）pg/ mL 比（666.13 ±134.21）pg/mL，P＜0.05］；與模型組比較，給藥組EGF水平顯著升高［（638.82± 154.54）pg/mL 比（558.13 ±87.84）pg/mL，P＜0.05］。

表2 給藥后大鼠潰瘍面積比較（，mm2，n=13）Tab.2 Comparison of ulcer area of rats after administration（，mm2，n=13）

表2 給藥后大鼠潰瘍面積比較（，mm2，n=13）Tab.2 Comparison of ulcer area of rats after administration（，mm2，n=13）

注：與模型組比較，*P ＜0.05。Note：Compared with those in the model group，*P ＜0.05.

組織病理情況：結果見圖1?？瞻捉M大鼠潰瘍組織可見毛囊腺體下有脂肪組織，無修復，毛囊及表皮完整。模型組可見組織間有水腫，脂肪細胞少；有經修復形成的角質化新的凹凸面，潰瘍面大；潰瘍區域未見毛囊再生。給藥組可見潰瘍后的修復，毛囊再生過程不完善，且脂肪細胞較模型組增多。

圖1 大鼠組織病理學觀察（HE，×200）A1，A2.Blank group B1，B2.Model group C1，C2.Administration groupFig.1 Histopathological observation of rats（HE，×200）

2.2 網絡藥理學

2.2.1 化學成分及靶點篩選

通過文獻挖掘及后續篩選，獲得西帕依固齦液化學成分7個；作用靶點54個，去重后得40個。結果見表3。分別從DrugBank，GeneCards，OMIM，TTD 數據庫中獲得DFU 作用靶點2 391，170，15，3 個，去重后共得靶點2 429 個。取交集共得到29 個靶點，詳見表4。

表3 西帕依固齦液化學成分及靶點數量Tab.3 Chemical composition and number of targets of Xipayi Mouth Rinse

表4 西帕依固齦液-DFU交集靶點Tab.4 Intersection targets of Xipayi Mouth Rinse -DFU

2.2.2 網絡構建

“成分-靶點”網絡：29個交集靶點與7個活性成分匹配后，最終得到6 個具有抗DFU 作用的活性成分，分別為鞣花酸（MOL001002）、沒食子酸（MOL000513）、沒食子酸甲酯（MOL001906）、沒食子酸乙酯（MOL001907）、丁香酸（MOL001807）、間雙沒食子酸（MOL000569），結果見圖2。

圖2 西帕依固齦液-DFU“成分-靶點”網絡Fig.2 ″Component-Target″ network of Xipayi Mouth Rinse-DFU

交集靶點PPI 網絡：29 個交集靶點的PPI 網絡包括29 個節點，140 條邊，平均Degree 值9.66，PPI 富集P值＜1.0×10-16；將該網絡關系導入Cytoscape 3.8.0軟件進行拓撲分析，第一輪篩選閾值為BC ≥6.677 777 778，CC ≥0.346 590 909，DC ≥9，EC ≥0.346 590 909，LAC ≥6.888 888 889，NC ≥7.75，共獲得9個中心節點。詳見圖3。

圖3 PPI拓撲分析圖Fig.3 PPI topological graph

2.2.3 富集分析

GO 功能富集：共得到1 240（q.value ＜0.05）個條目，包括生物過程（BP）1 094 條，分子功能（MF）127 條，細胞組分（CC）19 條；可視化處理各部分注釋結果的前10條，結果見圖4。西帕依固齦液治療DFU的靶點，主要參與調節對脂多糖、類固醇激素、細菌來源分子反應等過程的調控；作用主要體現在酰胺結合、RNA 聚合酶Ⅱ一般轉錄起始因子結合、肽結合等方面；主要集中于調控細胞質囊泡腔、囊泡腔、小窩等部位。

圖4 西帕依固齦液-DFU的GO功能富集可視化分析Fig.4 Visualization analysis of GO function enrichment of Xipayi Mouth Rinse-DFU

KEGG 通路富集：共得到124 條（q.value ＜0.05）信號通路，將前30條通路進行可視化處理，結果見圖5。主要涉及前列腺癌、鉑類耐藥、乙型肝炎、人類巨細胞病毒感染、癌癥中的蛋白多糖、膀胱癌、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、小細胞肺癌、IL-17 信號通路等。提示西帕依固齦液可能通過調節多個通路發揮治療DFU的作用。

圖5 西帕依固齦液-DFU的KEGG通路富集可視化分析Fig.5 Visualization analysis of KEGG pathway enrichment of Xipayi Mouth Rinse-DFU

2.2.4 分子對接

鞣花酸、沒食子酸、沒食子酸甲酯分別與細胞腫瘤抗原（TP53）、血管內皮生長因子A（VEGFA）、半胱氨酸蛋白酶-3（CASP3）進行分子對接，結合能均小于0 kcal/mol。分子對接結果見表5及圖6至圖8。

表5 核心成分與核心靶點的分子對接結果Tab.6 Results of molecular docking between key components and key targets

圖6 鞣花酸-核心靶點的分子對接結構圖A.Ellagic acid-TP53 B.Ellagic acid-VEGFA C.Ellagic acid-CASP3Fig.6 Molecular docking structure of ellagic acid-key targets

圖7 沒食子酸-核心靶點的分子對接結構圖A.Gallic acid-TP53 B.Gallic acid-VEGFA C.Gallic acid-CASP3Fig.7 Molecular docking structure of gallic acid-key targets

圖8 沒食子酸甲酯-核心靶點的分子對接結構圖A.Methyl gallate-TP53 B.Methyl gallate-VEGFA C.Methyl gallate-CASP3Fig.8 Molecular docking structure of methyl gallate-key targets

3 討論

DFU 多種病因共存，目前尚未完全闡明其發病機制。目前普遍認為其主要與足周圍神經病變、血管病變及足部感染有關。DFU 發生的主要危險因素之一是足周圍神經病變，其主要累及感覺神經、運動神經和自主神經，尤其末梢神經病變。血管病變亦是影響DFU 預后的重要因素之一，其中包括微血管病變和大血管病變。動脈粥樣硬化是大血管病變的主要病理改變，多數學者考慮DFU 的主要發病機制之一是下肢動脈硬化。感染是DFU 的發生并趨于加重的重要原因之一，其增加局部耗氧及促凝物質產生，加重缺血，從而加重壞疽［5］。

測量DFU 模型大鼠潰瘍面積采用計算機像素點法（以中國人民銀行1角硬幣為參照物）。于電腦繪圖工具中分別圈索出潰瘍區域與硬幣區域，記錄像素點。以潰瘍區域像素點和硬幣像素點的比值乘以硬幣的面積，即得大鼠足部潰瘍區域的面積。潰瘍創面的愈合是創面修復的過程。脂肪細胞對創面修復有重要作用，能分泌合成轉化生長因子1、血管內皮生長因子、腫瘤壞死因子-α、骨形成蛋白等60 多種蛋白［6］，從而促進表皮細胞的增殖和分化，進而形成良好的表皮層結構。毛囊與皮膚創面的修復及瘢痕的形成具有密切關系，其再生程度可反映潰瘍創傷深部及表層的修復情況。關于毛囊與創傷修復的研究證實，毛囊單位可有效促進創面愈合［7-8］。

有研究表明，EGF 可增加DFU 患者傷口處的膠原含量，促進肉芽組織快速形成，有利于傷口的愈合。本研究中也發現，西帕依固齦液可顯著增加DFU 模型大鼠的EGF水平，促進創面愈合［9-12］。

沒食子作為西帕依固齦液主要組成藥材，其主要活性成分為沒食子酸、鞣花酸等成分，具有固澀、收斂、燥濕、止血、消炎等功效［13］。成分-靶點網絡顯示，西帕依固齦液抗DFU 的核心成分可能是鞣花酸、沒食子酸等。鞣花酸屬鞣質類成分，具有抗炎、抗氧化、抗菌、降糖、調脂作用［14-16］。沒食子酸具有顯著的抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化等作用，對心血管系統疾病、神經系統疾病、糖尿病、肝纖維化和腫瘤等具有防治作用［17-18］。PPI 網絡顯示，TP53，VEGFA，CASP3 等為核心靶點。TP53 具有調控細胞分裂和增殖的作用。VEGFA 在血管的生成和發生及內皮細胞生長中有重要作用，可誘導內皮細胞增殖、促進細胞遷移、抑制凋亡并誘導血管通透性，對生理和病理性血管生成均必需。CASP3 在細胞凋亡的執行階段起關鍵作用，與癌癥的發生、衰老、心血管疾病的發生等有重要聯系。KEGG 富集分析顯示，PI3K-Akt、NF-κB信號通路等為核心通路。PI3K/Akt信號通路可介導多種細胞信號傳遞并調節細胞自噬、增殖、轉錄、翻譯等多個過程［19］。PI3K-Akt-mTOR 信號通路有獨立的激活劑，介導內皮細胞遷移、促進新生血管形成，從而促進DFU 愈合［20］。細胞外囊泡是PI3KAkt-mTOR信號通路的激活劑之一，可通過激活PI3KAkt-mTOR通路，加速血管內皮細胞的遷移，增加傷口的血管密度，從而促進糖尿病小鼠的創面愈合［21-22］。NF-κB是一種異源性二聚體，它不僅與慢性低度炎癥相關還與糖尿病等代謝性疾病相關。DFU創面愈合可由JNK-NFκB-NLRP3信號通路介導，NF-κB、NLRP3活化時可使糖尿病創面的炎癥細胞浸潤，延長炎癥持續狀態，減慢糖尿病創面的愈合速度［19］。

綜上所述，西帕依固齦液可通過減少足部潰瘍面積，增加病灶組織的脂肪細胞和再生毛囊數量，發揮抗大鼠DFU作用。其作用機制可能與西帕依固齦液中鞣花酸、沒食子酸等核心成分作用于TP53，VEGFA，CASP3等核心靶點，繼而影響PI3K-Akt、NF-κB 等信號通路有關。本研究為后續西帕依固齦液治療DFU的藥物效應動力學及機制研究奠定了基礎，并為西帕依固齦液二次開發利用研究提供參考依據。