產酯酵母在發酵食品中的應用研究進展

袁海珊，劉功良，白衛東，肖更生，梁景龍

（1.仲愷農業工程學院 輕工食品學院 廣東省嶺南特色食品科學與技術重點實驗室，廣東 廣州 510225；2.仲愷農業工程學院 輕工食品學院 農業農村部嶺南特色食品綠色加工與智能制造重點實驗室，廣東 廣州 510225）

我國的傳統發酵食品歷史悠久，種類繁多，因其獨特的風味以及豐富的營養成分，逐漸成為人們生活中不可或缺的一類食品，也是食品產業中的重要組成部分。發酵食品是指經過所需的微生物發酵作用或生物酶轉化作用而制成的食品[1]，微生物作為發酵過程中的主力軍，不僅對發酵產品的成敗起決定性的作用，而且微生物代謝作用還賦予了產品獨特的色澤、質地、口感、風味、營養等，在一定程度上提升了產品的感官質量。

產酯酵母是一類能夠代謝產生酯類物質的酵母菌，因其能合成具有芳香氣味的酯類物質[2]，也被稱為產香酵母。除此之外，產酯酵母能通過自身的代謝使發酵過程產生醇類、酯類、酚類、酮類等具有揮發性的風味物質。不同菌種產酯情況各異，在酒類、調味品、功能飲料等發酵食品當中的作用也有所差異，因此，選育合適的產酯酵母并合理應用，能有效改善發酵產品的風味。為此，本文將對發酵食品中產酯酵母的來源、產酯機理及應用進行全面地綜述，以期為提升和改善產酯酵母在發酵食品風味中的研究提供參考。

1 產酯酵母的來源

產酯酵母多為野生酵母，是發酵食品中的重要產香菌株，具有較強的產酯能力，不同的產酯酵母產生的香氣略有不同。目前，產酯酵母的來源豐富，可從酒曲、果酒、果汁、水果、泡菜、醬醅等食品原料中分離出來，如表1所示，在發酵食品的釀造過程中，它們是形成食品香氣成分的重要菌群。

表1 產酯酵母的來源及其種類Table 1 Sources and species of ester-producing yeast

產酯酵母的培養條件與其他酵母菌并無明顯差別，但其氧化特性和產酯能力較強，溫度、pH等環境因素的變化也會影響產酯酵母的生長代謝。漢遜酵母（Hansenula）、球擬酵母（Torulopsis）和假絲酵母（Candida）是白酒生產中使用得最多的產酯酵母菌，旨在提高酒的主體香含量；而易變球擬酵母（Torulopsis versatilis）、埃契氏球擬酵母（Torulopsis etchellsii）和蒙奇球擬酵母（Torulopsis mogii）則是生產醬油中使用得最多的耐鹽性產酯酵母菌，可提高醬油的醬香，它們的共同特點是能產生酯類等芳香物質，豐富產品的風味。

2 產酯酵母的產酯機理

酯類物質主要為產品提供果香與花香等芳香氣味，與酸類和醇類物質相比，大部分酯類物質的氣味閾值較低，但對風味的貢獻較大，因此，了解產酯酵母的產酯機制，以便能夠更好地控制其在產品中的含量以及促進產酯酵母在發酵食品中的應用。不同的產酯酵母產生的香氣各不相同，不同的代謝途徑產生的物質也各不相同。

酯類物質的合成有醇類（乙醇或高級醇）、脂肪酸、輔酶A和醇乙酰基轉移酶（alcohol acyltransferase，AATase）等物質參與。主要途徑有三種：一是微生物酶酯化反應途徑。這一反應途徑主要由發酵過程中微生物的代謝反應生成。醇和酸是合成酯類物質的重要底物，發酵過程中的乙醇主要是由酵母菌在厭氧條件下發酵產生，在乙醇生產過程中，氨基酸分解代謝途徑與生物合成產生高級醇[15]。酸類物質主要由發酵過程中的微生物代謝生成，在脂肪酶、酯酶、角質酶等羧酸酯水解酶的作用下，酸類和醇類通過催化反應生成相應的酯[19]；二是醇乙酰基轉移酶途徑。研究表明，醇乙酰基轉移酶是生物體內化學反應合成酯的關鍵酶[20]，該酶在乙酸酯類的生物催化合成中有著重要作用。醇乙酰基轉移酶通過催化乙酰輔酶A與乙醇、異戊醇、異丁醇等醇類作用生成乙酸酯[21]；在酵母合成其他酯類物質的過程中，脂肪酸需與輔酶A先結合，形成相應的酰基輔酶A[22]，醇乙酰基轉移酶再通過催化相應的酰基輔酶A與乙醇作用生成脂肪酸乙酯[23]；三是化學反應途徑。在發酵后期以及儲存過程中，醇類和酯類物質通過簡單的有機化學反應合成相應的酯。

3 產酯酵母的應用

3.1 產酯酵母在白酒中的應用

我國的白酒香型主要有四種：分別是醬香型、濃香型、清香型以及米香型[24]。不同香型的白酒其主要的呈味物質也有所不同。白酒中的酯類物質主要是乙酯，占所有酯類的46.29%[25]。醬香型白酒主要的呈香物質是己酸乙酯和丁酸乙酯[26]；濃香型白酒主要的呈香物質是己酸乙酯[27]；清香型和米香型白酒中主要的呈香物質則是乙酸乙酯和乳酸乙酯[28]。可以看出，酯類物質是決定白酒風格與品質的關鍵化合物。為了增加白酒中的獨特香氣，在生產過程中會加入特定的添加劑，但酒體香氣仍然單薄，口味較淡，但產酯酵母的加入使得酒體中的風味物質更加豐富，且口感更為獨特。在白酒發酵過程中，產酯酵母以糖類、有機酸等為營養成分，在酯酶作用下合成酯類物質，促進白酒特征性風味物質的形成[29]，可在一定程度上改善白酒香氣不足和口感不醇厚等問題。

釀酒酵母屬（Saccharomyces）是主要產生酒精的一類酵母菌屬；非釀酒酵母屬主要包括畢赤酵母屬（Pichia）、假絲酵母屬（Candida）、有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）等，主要產生酯類等芳香化合物。其中，漢遜酵母是在白酒生產中應用最多的產酯酵母[30]。明紅梅等[5]從濃香型大曲中分離出一株耐高溫酵母菌株，經分子生物學鑒定J3為異常威克漢姆酵母（W.anomala），其產2-正戊基呋喃、苯乙醇等香氣物質的含量較高，為大曲酒的香氣帶來重要貢獻。夏玙等[31]從大曲中分離篩選出一株異常威克漢遜酵母（W.anomalus），將其用于麩曲制作并應用于清香型小曲白酒釀造中，可使乙酸乙酯和總酯含量顯著提升，清香型白酒風格更為突出，口感更佳。

白酒的風格和質量受乙酸乙酯的影響很大，產酯酵母則在產乙酸乙酯方面超越了細菌和霉菌，利用產酯酵母提高白酒中乙酸乙酯的含量已成為許多學者的首要選擇。董士偉等[32]在豉香型白酒發酵環境中分離得到一株優良產酯酵母，將其強化應用于豉香型白酒中，其產乙酸乙酯含量提高了49%，且酒體的香氣更為突出。劉小改等[33]將一株高產乙酸乙酯的產酯酵母J-4用于清香型麩曲白酒釀造，其產乙酸乙酯含量高達1.07 g/L，總酯含量比空白組提高了50.7%，改善了原酒的口感，提升了原酒的品質。FAN G S等[34]研究了異常威克漢姆酵母（W.anomalus）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）共同作用對乙酸乙酯產量的影響，發現兩種酵母之間的使用配比為3∶1時，產生的乙酸乙酯高達6.41 g/L。兩種酵母的協同發酵不僅提高了乙酸乙酯的產量，而且增加了其他風味化合物的含量，如β-苯乙醇和苯乙酸乙酯等。

拜耳接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）是各種發酵食品中常見的產酯酵母，其廣泛存在于酒、茶、醋等中[35-36]。XU Y等[37]研究了Z.bailii在醬香型白酒發酵液中的發酵特性，結果顯示，它能產生包括醇、酸、酯、醛和酮在內的多種風味化合物。此外，與30 ℃相比，在37 ℃時（白酒發酵的最高溫度），酸和醛的產量分別增加了110%和41%，有利于提升白酒的香氣和品質。李海營[38]從窖泥、酒曲以及酒糟中分離得到5株酵母菌，經鑒定其中一株為拜耳接合酵母（Z.bailii），將其用于酵母液體曲的制備，進行液體白酒發酵，結果表明，總酯含量以及乙酸乙酯含量都有所提升，白酒香氣清正，入口綿甜，達到國家清香型白酒優級標準。

3.2 產酯酵母在果酒中的應用

果酒是通過壓榨新鮮水果取其汁液，經過發酵而成的低酒精度發酵酒。因其能保留水果中部分營養物質，越來越受到群眾的喜愛，果酒行業由此不斷進入深發展。葡萄酒是世界上被消費最多的一種果酒。隨著消費者需求的日益多樣化，市場上的果酒種類也越來越豐富[39]。目前市場上已有的果酒包括荔枝酒、蘋果酒、梅子酒、藍莓酒等[40-43]。水果表皮上的野生酵母能利用水果本身的糖分產生酒精，生成果酒。而酵母菌株在果酒香氣和風味的形成上起著重要作用[44]，雖然果皮表面上的野生酵母能用于酒精發酵，但容易受到污染或者生產出來的果酒風味不佳。為了提高果酒的產量以及縮短發酵周期，目前果酒的釀造大多采用單一菌種發酵，如釀酒酵母（S.cerevisiae），雖然釀酒酵母有較強的產酒精能力，但產香能力不足。

近年有研究表明，非釀酒酵母的加入在果酒生產中可起到增加香氣、豐富口感的作用[45]。在發酵初期，非釀酒酵母菌的生長會產生一些影響果酒香氣的重要成分，使果酒的口感和香氣更為復雜。果香和花香是果酒散發出的特有清香，有報道顯示，這與發酵過程中產生的乙酸酯密切相關[46]。酯類物質是構成酒體香氣的主要成分，在果酒發酵過程中，產酯酵母能分泌葡萄糖苷酶、果膠酶、蛋白酶等酶類，在代謝過程中產生許多酯類、醇類、酸類等香氣化合物，可有效提升果酒的風味，使酒體更為濃郁協調。因此，產酯酵母也常常被用于與釀酒酵母一同混合發酵，成為果酒添加菌種中最受歡迎的菌種之一。

葉萌祺等[47]從蘋果庫空氣樣以及蘋果樣品中分離純化得到6株產酯酵母菌，經鑒定菌株YN6為異常威克漢姆酵母（W.anomalus），將其與蘋果酒酵母WLS21混合發酵，與對照菌株WLS21獨立發酵結果相比，酒體中揮發性香氣成分的種類（包括丙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸-2-甲基丙基酯、乙酸異丁酯、乙酸丁酯和壬醛）和含量均顯著提高，主要揮發性香氣物質的質量濃度提高了約2倍。張陽等[48]將葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）與釀酒酵母進行混合蘋果酒發酵，與釀酒酵母單一發酵相比，混合發酵蘋果酒中香氣物質種類明顯增多，乙酸酯類和萜烯類等物質含量也先顯著提高，且脂肪酸類物質含量顯著降低，豐富了蘋果酒的香氣，酒體果香清雅、濃郁舒適。LU Y U等[49]研究戴爾凱氏有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）和耐熱克魯維酵母（Kluyveromyces thermotolerans）對榴蓮酒發酵的影響，發現這兩株菌發酵的榴蓮酒中存在更多的高級醇和乙酯，酒體風味更醇厚，口感更為豐富。BINATI R L等[50]研究了混合接種對葡萄酒品質的影響，通過同時接種和順序接種本地非釀酒酵母，與單獨接種釀酒酵母相比，梅奇氏酵母（Metschnikowiaspp.）能有效促進高級醇和酯類物質的產生，并且能減少揮發性苯酚，對葡萄酒的香氣和成分有積極影響。陳清嬋等[51]從橘子果實上分離篩選出一株優良產香酵母菌株JZ-3，該菌株釀造出來的橘子酒酒體豐滿醇厚，氣相色譜分析結果顯示含香氣物質22種，保留了橘子的清新淡雅，整體酒香協調、口感純正。

3.3 產酯酵母在黃酒中的應用

黃酒因其獨特的香氣、微妙的風味和較低的酒精含量，在中國東南部地區廣受歡迎[52]。經過長達數千年的發展，產生了許多具有地域代表性的黃酒，如紹興黃酒、山東蘭陵酒、金華酒、代州黃酒、河南雙黃酒等。黃酒是一種復雜的混合物，除了乙醇外，還存在多種化合物，且風味化合物來源廣泛，如原料、酒曲、發酵過程中的微生物代謝活動、陳釀過程中發生的化學反應等[53]。在這些來源中，微生物對黃酒風味品質的影響最大，黃酒的風味物質很大程度上決定了黃酒的品質。由于黃酒發酵過程中微生物組成復雜，中國黃酒行業普遍采用純種酵母發酵。然而，純種酵母發酵的黃酒微生物群落結構相對簡單，導致黃酒的風味不夠獨特、口感不夠醇厚，因此，黃酒發酵過程中微生物菌群結構對香氣物質的產生有著重要作用。混合菌種發酵已被證明可以增加黃酒風味的多樣性，改善黃酒的品質[54]。在黃酒發酵過程中，酵母菌可將糖轉化為乙醇和二氧化碳，同時產生高級醇、酸、酯、醛類等物質，這極大地影響了黃酒的香氣。通過添加產酯酵母進行混合發酵，可有效改善黃酒的一些不足之處，如口感偏苦、香氣不足、酒精度偏高等問題。

釀造過程中的產酯酵母菌是黃酒發酵過程中產生揮發性芳香化合物的主要菌群。蔡君等[55]采用黃酒釀制復式發酵工藝，酶法活性多肽生物發酵技術釀制新型生物多肽黃酒，在發酵過程中添加假絲酵母AS2.1182和球似酵母AS2.202，以1∶1比例混合，能顯著改善黃酒的風味，使黃酒香氣更濃郁，口感更舒暢，并且品質要優于傳統黃酒。張彭湃等[56]在黃酒釀造過程中同時加入產酯酵母與普通黃酒酵母，進行共同發酵，發現產酯酵母的加入使黃酒香氣更濃郁，相比于普通黃酒，加入產酯酵母的黃酒感官評定有較大幅度的提高，總酯含量是黃酒酵母單獨發酵酒的1.6倍，檢測出酯類物質的種類也多于黃酒酵母單獨發酵。YAN S B等[57]分離篩選出一株異常威克漢姆酵母HN006，將該產酯酵母添加于百合黃酒發酵，釀造的黃酒中總氨基酸含量和感官評分更高，此外還產生了更多的酯類、游離脂肪酸、醇類、酮類、酚類等物質，有效增強了百合黃酒的香氣。乙酸是黃酒中重要的酸類物質之一，也是合成乙酸乙酯的前體物質，酸類和酯類共同構成黃酒和諧的口感。劉夢等[58]以糯米糖化液為發酵基質，將一株馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）HY32與釀酒酵母TRADY混合發酵，與單一釀酒酵母發酵相比，混合發酵中黃酒發酵液的乙酸乙酯和乙酸含量都有大幅提升，同時發酵液中的酸類、酯類、醛類等物質含量也有所提高，此外，還產生了兩種新的風味物質，分別是具有菠蘿香氣的己酸乙酯和在酒類中起緩沖作用的2,3-丁二醇，混合發酵使酒體醇香濃郁、綿甜柔和，有效改善了黃酒的品質。

3.4 產酯酵母在醬油中的應用

醬油作為一種傳統調味品，是我國傳統食品行業的一個重要領域，在亞洲各國的飲食文化中也占有重要地位。我國醬油生產主要采用低鹽固態發酵工藝，由于其原料利用率高、發酵周期短、生產成本低，故長期以來受到釀造行業人士的青睞。但是，與高鹽稀態發酵工藝相比，采用低鹽固態發酵工藝釀造出來的醬油風味較差。醬油的醬香和酯香決定了醬油的風味品質，醬油風味是霉菌、細菌和酵母等共同作用的結果，復雜的微生物相互作用在發酵過程中對風味的形成起著至關重要的作用[59]。對醬油風味貢獻最大的微生物是酵母菌和乳酸菌，其中關系最密切的酵母菌有魯氏酵母、易變球擬酵母、埃契氏球擬酵母、無名球擬酵母和醬醪接合酵母[60]，這些酵母大多在發酵后期出現，是產酯類酵母菌，這些酵母菌利用曲霉代謝過程中生成的糖類和氨基酸產生乙醇[61]，隨后乙醇與酸反應生成醬油的風味成分。乳酸菌在醬醪發酵過程中可降低發酵醪的pH，不僅能促進魯氏酵母的繁殖，還能與酵母菌聯合生成醬油的特殊香氣成分—糠醇。傳統的醬油生產是采用天然露曬、自然接種的方式，靠空氣中微生物發霉制曲，后來變為純種釀造，但其生產周期長、酶系單一、產品質量不穩定，且因發酵體系中酶系單一而造成原料無法被徹底分解。為了改善這些缺點，嘗試采用多菌種發酵，通過在發酵過程中添加細菌或生香酵母，使多菌種協同發酵，產生更多香氣物質的前驅物來提高醬油的風味。

魯氏接合酵母、假絲酵母和球擬酵母都是醬油生產中常見的生香酵母，這些酵母菌可生成乙醇、高級醇、羥基-呋喃酮類和4-乙基愈瘡木酚等[62]，在醬油發酵過程中生成獨特的風味物質，其中耐鹽性酵母菌則是眾多酵母菌中最能為醬油風味作出巨大貢獻的酵母菌。李學偉等[63]將耐鹽醬油酵母添加到低鹽稀態醬油中進行生香發酵，總酸、總酯、酒精度顯著提高，醇類和酯類物質提高了接近2倍，且醛類和揮發性酸類物質下降明顯，生香發酵后的醬油香氣柔和、醇香濃郁。用優良的產香酵母發酵可以增強醬油的風味，JIANG X W等[64]分別在醬油高鹽液態醪液中加入三種酵母：粉狀米勒酵母（Millerozyma farinosa）、魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）和近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis），三種酵母的添加都促進了醬油揮發性酯類物質含量的增加，其中添加Z.rouxii高達到1.03 g/L。WAH T T等[65]研究了Z.rouxii和季也蒙畢赤酵母（Pichia guilliermondii）菌株在泰國醬油發酵中揮發性風味化合物（volatile flavour compound，VFC）生產中的作用，酵母接種增強了醪液中VFC的產生，其中乙醇、醇、呋喃酮、酯、醛、酸、吡喃酮和酚的含量有所提高，這些都是醬油中重要的特征風味化合物。此外，與Z.rouxii的單一培養物相比，協同發酵能產生更多的醇、呋喃酮、酯、麥芽酚和苯甲酸，進而有效增強了醬油的風味。

3 結論與展望

產酯酵母具有較強的產酯能力，同時還能產生酸類、醇類、醛類、酮類等物質，為發酵食品的風味帶來重要的作用。到目前為止，產酯酵母的應用仍處于研究階段，能直接用于生產的產酯酵母菌較少，因發酵食品生產條件導致菌株需要耐受較高的酒精度、較高的鹽濃度、較高的溫度等特殊性能，因此，產酯酵母的選育有待進一步研究。在發酵食品中，除了考慮添加產酯酵母提高產品的風味和品質以外，可考慮多菌種相互作用、基因工程改造功能菌株等技術手段，提高發酵體系中酯類物質的含量。另外，可利用現代化測序技術、組學技術等進一步研究產酯酵母的作用機理、發酵過程中對微生物變化的影響，探討產酯酵母與風味物質間形成的關系，從而能科學地指導傳統發酵產業的升級，提高經濟效益。

目前，產酯酵母的研究應用主要集中在發酵食品方面，加入產酯酵母進行強化發酵，可使發酵過程中短時間內生成芳香物質，縮短發酵周期，降低生產成本，提高產品質量。產酯酵母的發展空間仍然很大，應最大程度利用產酯酵母菌的優勢去研究和開發出更多的新型產品，未來可考慮應用于其他領域，如食品酶類的生產和香精香料的生產等，有針對性地選育產酯酵母，不斷深入研究，開發新型產品，進行技術革新，提高產品品質。