產香酵母發酵面團揮發性風味物質分析

趙暢雯，潘曉倩，成曉瑜，林冬梅

（1.河北工程大學 生命科學與食品工程學院，河北 邯鄲 056000；2.北京食品科學研究院，北京 100068）

酵子由小麥粉、水自然發酵制成，是由多種能產氣產香的活性微生物組成的發酵劑和生物疏松劑[1-3]。作為傳統發酵劑，酵子發酵后的面食咀嚼性較高，具有質地松軟、香氣豐富等特點[4]。但是酵子中微生物組成不穩定[5]，易受外界環境的影響，且各地使用酵子發酵制成的面食的香氣物質具有區域性和局限性，因此使得傳統發酵劑逐漸被干粉發酵劑所取代。酵子中的優勢菌種是酵母菌[6]，酵母菌可將面粉中的糖類物質轉化為醇類、酯類以及其他芳香氣味物質[7]。研究發現，酵子中的產香酵母可以改善面團的發酵、饅頭風味和滋味[8]，饅頭揮發性風味成分的種類和含量均有所增長[9]。添加產香酵母發酵的面團，揮發性風味成分明顯提高，醇類和酯類增幅明顯[10]。其中的乙醇、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、異戊醇等都是發酵面食中常見的揮發性風味成分。應用酵子中優勢酵母發酵面團，其面團比容得到優化且高于國標要求[11-12]。綜上所述，目前研究逐漸偏向酵子中優良發酵性能酵母資源的開發。

我國發酵面食的主產地分布在各小麥產區，但目前傳統面食發酵劑的研究主要集中在內蒙古及河南地區[13]，而對山東地區酵子的研究較少，山東酵子饅頭與普通酵母饅頭相比，香氣具有明顯差異[14]。因此，本研究選擇酵子中優良代表性菌株分析其生長和發酵特性，將酵母菌接種到面團中培養不同時間，結合感官評價和氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用技術分析其風味代謝特征，以期為發酵面食生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：本實驗室從山東德州手工酵子中分離純化得到，保存于中國肉類食品綜合研究中心，保藏號CGMCC NO.24005。

面粉：益海嘉里金龍魚糧油食品有限公司；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone glucose，YPD）培養基、YPD肉湯培養基：北京奧博星生物技術股份有限責任公司；脫脂乳粉：美國BDifco/BBL公司；2-甲基-3-庚酮標準品（色譜純）、C8～C20系列正構烷烴：美國Sigma公司；氦氣（He）（純度＞99.999%）：北京氦普北方氣體工業有限公司。

1.2 儀器與設備

動態頂空制樣瓶：自制；TSQ8000氣相色譜-質譜（GC-MS）聯用儀、TG-Wax MS極性色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）：美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Centrifuge 5417R冷凍離心機：德國Eppendorf公司；Synergy H4 型酶標儀：德國BioTek公司；2-6D LSC plus真空冷凍干燥機：德國CHRIST凍干機有限公司；AC2-4S1生物安全柜：新加坡藝思高公司；LHS-100CL恒溫恒濕培養箱：上海一恒儀器設備有限公司；GI54DWS高壓滅菌鍋：美國zealway公司；DZKW-4電子恒溫水浴鍋：北京中興偉業儀器有限公司；WBL-MS503M揉面機：惠而浦（中國）股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株的活化及發酵劑的制備

菌株活化：將酵母菌接種于YPD液體培養基中，28 ℃恒溫培養24 h，傳代活化2次。

脫脂乳粉保護劑的制備：將100 mL水在121 ℃條件下滅菌15 min后，添加10 g脫脂乳粉，巴氏殺菌后作為保護劑。

酵母菌發酵劑的制備：將活化后進入穩定期的產香酵母發酵液按照25%的添加量加入保護劑中混勻后，分裝于無菌凍干瓶中，預凍后凍干，制成干粉發酵劑。

1.3.2 發酵面團的制作

在200.0 g面粉中加入0.2 g的干粉發酵劑，加入90 mL無菌水用揉面機迅速攪拌成面團狀，置于28℃條件下培養24h。

1.3.3 菌株生長特性

最適pH：將活化好的菌株以1%接種量接種到15 mL YPD肉湯培養基中，調節培養基的pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，28 ℃條件下120 r/min培養24 h。利用酶標儀在波長600 nm處測定其OD600nm值。

最適溫度：將活化后的菌株按1%接種量接種在pH自然（pH6）的培養基中，26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃條件下120 r/min培養24 h，測定方法同最適pH。

1.3.4 測定方法

（1）菌株發酵力：參照MICHELA P等[15]的方法并適當修改，將5 g面團置于20 mL有刻度的量筒中，每隔4 h記錄面團體積情況。

（2）感官評價：采用定量描述分析（quantitaive descriptive analysis，QDA）法對酵母菌發酵面團的香氣特征進行評價。QDA法是一種綜合性的感官評定方法，不僅能描述樣品感官特征，而且可以清晰的展現樣品間差異。香氣特征的描述詞由10名訓練有素的食品感官品評員依照文獻[16]、GB 7099—2015《食品安全國家標準 糕點、面包》[17]和GB/T 21118—2007《小麥粉饅頭》[18]并參考文獻[18]，最終將香氣特征詞確定為水果香、花香、酒香、脂肪香、麥香、堅果香、酯香和整體香氣。發酵面團香氣強度感官評分標準見表1。

表1 發酵面團香氣強度感官強度評分標準Table 1 Sensory evaluation standards of aroma intensity of fermented dough

（3）揮發性風味化合物提取與測定：參照潘曉倩等[19]的方法并適當修改。將15 g發酵面團加入頂空瓶中并迅速在其中加入1 μL 2-甲基-3-庚酮（內標，0.816 μg/μL）在45 ℃水浴中平衡10 min，將老化后的萃取頭在45 ℃吸附40 min后，插入GC-MS儀進樣口分析。

GC條件：TG-WaxMS極性色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；采用不分流模式；載氣為高純氦氣（He）；流速1.0 mL/min，保持2 min；進樣口溫度250 ℃。升溫程序：柱溫40 ℃維持3 min；以5 ℃/min升至200 ℃，維持1 min；再以8 ℃/min升至220 ℃維持3 min。

MS條件：電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量70 eV，離子源溫度280 ℃；接口溫度260 ℃；傳輸線溫度230℃；采用全掃描模式，質量掃描范圍40～400m/z，掃描2s。

定性分析：譜庫檢索鑒定根據待測化合物質譜圖，與美國國家標準與技術研究院（national institute of standards and technology，NIST）和Wiley數據庫進行比對，計算反相似度指數（reverse similarity index，RSI）和正相似度指數（similarity index，SI）均大于750的化合物的保留指數（retention index，RI）值并與數據庫（http：//www.flavornet.org/）比對，從而對面團中的揮發性風味物質進行定性分析。RI計算公式如下：

式中：N代表低碳原子數正構烷烴碳原子數；n代表高低原子數正構烷烴碳原子數差；tx、tN+n、tN分別為待測化合物、高碳原子數正構烷烴和低碳原子數正構烷烴在相同條件下的保留時間，min。

半定量分析：根據已知內標的含量計算待測風味化合物相對于內標物的含量，揮發性風味成分含量計算公式如下：

1.3.5 數據統計與分析

采用SPSS Statistics 20.0對數據進行顯著性差異分析和相關性分析。利用Origin Pro 2021軟件進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和繪圖。

2 結果與分析

2.1 菌株生長特性

2.1.1 菌株生長的最適pH和溫度

環境的pH變化會影響酵母原生質膜所帶電荷改變，導致原生質膜滲透性變化，進而影響菌體吸收營養物質、酶活、代謝途徑[20]。溫度是影響酵母菌生長的重要因素，在最適溫度條件下細胞內生化和酶反應速率達到最大[20]。酵母菌最適生長pH及最適生長溫度見圖1。由圖1可知，在不同pH和溫度條件下，OD600nm值均呈現先上升后下降的趨勢。由圖1（a）可知，酵母在pH3～10的條件下均能生長，有較好的pH適應性；該酵母菌的最適生長pH為6（自然pH），這與文獻[10]結果類似。發酵過程中產生的酸類物質[18]使培養基體系中氫離子增加，pH降低。此酵母最適生長pH比一般酵母（4.0～5.5）高。從圖1（b）可知，酵母在26～35 ℃條件下均能生長，最適生長溫度為28 ℃。當溫度高于28 ℃時，隨溫度的升高，生存力逐漸減弱，當溫度高于32 ℃時，酵母生長被明顯抑制，該結果與大多數酵母生長最適生長溫度習性相符合。

圖1 酵母菌生長最適pH（a）及最適溫度（b）測定結果Fig.1 Determination results of the optimal pH (a) and temperature (b) of the yeast growth

2.1.2 菌株的發酵力

發酵力可展現為酵母的產氣量及添加酵母的面團體積變化量。二氧化碳足量時能保證面團結構的充分延伸和膨脹。酵母發酵時會發生一系列的生化反應，在此過程中產生的CO2能保留在發酵面團內部使面團膨脹，使面筋得到充分延展，從而賦予面食松軟的特性。在最適生長環境下，酵母菌自身活性是決定面團膨脹能力的重要指標。

由圖2可知，發酵0～4 h時酵母在細胞內積累所需酶等物質，導致產氣速度較慢。發酵8～16 h時酵母產氣較快，面團體積迅速增大，8 h面團體積已增加至初始時的2倍。發酵一段時間后，酵母進入生長穩定期，面團體積不再增加。發酵16 h后出現塌陷現象，這可能是由于發酵前期產氣速度快，面團內CO2量達到頂峰導致內部形成高壓，而過量的CO2超過面筋的彈性極限，氣體溢出時使面筋網絡斷裂，導致面團體積減小[21]。

圖2 酵母菌發酵力測定結果Fig.2 Determination results of the yeast fermentation capacity

2.2 酵母菌株發酵不同時間面團呈香差異分析

由圖3可知，與未發酵組（0 h）相比，發酵組面團的香氣強度有明顯增強，且隨發酵時間的延長，香氣特征逐漸明顯，其中發酵24 h組的香氣特征最明顯。花香、水果香、酯香均明顯增加。但隨著發酵時間的延長產生的醇類物質增加，導致酒香味評分也逐漸增高，過重的酒味會對面團產生消極影響。5組面團中，整體香氣強度評價最高的是發酵24 h組，發酵18 h組次之。

圖3 不同發酵時間面團的香氣強度感官評價結果Fig.3 Aroma intensity sensory evaluation results of dough with different fermentation time

2.3 酵母菌株發酵面團的揮發性香氣物質分析

通過SPME-GC-MS測定共檢測到揮發性香氣物質44種，包括酯類14種，醇類12種、醛類6種、酸類5種及其他化合物7種。和0 h（未發酵組）相比，發酵面團中主要的香氣來源—醇類、酯類等含量均大幅增加。

2.3.1 醇類化合物分析

由表2可知，未發酵面團檢出3種醇類物質，總含量為2.07 μg/kg；發酵6 h面團檢出7種醇類物質，總含量為9.60 μg/kg；發酵12 h面團檢出7種醇類物質，總含量為66.51 μg/kg；發酵18 h面團檢出8種醇類物質，總含量為108.86 μg/kg；發酵24 h面團檢出10種醇類物質，總含量為113.21 μg/kg。發酵0 h（未發酵）組中乙醇呈甜味，正己醇呈樹脂、花等氣味，正辛醇呈玫瑰、青香味。24 h組檢出乙醇、丙醇、異丁醇、異戊醇、正戊醇、1-辛烯-3-醇、2-癸烯-1-醇、糠醇、苯甲醇、苯乙醇。與未發酵面團組相比，發酵組面團的醇類化合物種類與含量均顯著性上升（P＜0.05）。正己醇是面粉中由脂肪氧化產生的醇類，已被證實是普通小麥面粉中的主要醇類物質[22]，同時也是面包中的一種常見揮發性風味成分。在酵子面團中，發酵初期檢測到了正辛醇的存在，同邢小龍[23]研究結果，正辛醇還是紫糯配粉饅頭特殊香氣的來源[24]。乙醇在發酵后期含量最高，6 h起顯著上升（P＜0.05），24 h組中乙醇的含量是0 h組中乙醇含量的160倍。在發酵面團中檢測到正戊醇、1-辛烯-3-醇，這一結果與KIM Y等[25]的研究結果相似。在發酵24 h組檢測到1-辛烯-3-醇可能與發酵時間過長有關[26]。在面團中檢測到苯乙醇，可能是由于酵母細胞中由面粉纈氨酸和苯丙氨酸的降解形成苯乙醇[27]，同理纈氨酸降解可能導致異丁醇的產生。異戊醇是酵母發酵面團中含量排第二的醇，是酵母將面團中亮基酸通過Ehrlich途徑分解代謝的發酵產物[28-29]，是一種被發現有助于促進花香和果香的化合物[30]，并且它與酒精和麥芽風味呈正相關[5]。己醇具有強烈的草和花的香味。釀酒酵母可以高效將L-苯丙氨酸轉化為β-苯乙醇。隨著發酵時間的增加，苯乙醇含量逐漸增高[31]。該菌株產苯乙醇能力較強，苯乙醇為發酵面團提供具有新鮮面包的氣味和甜玫瑰般的花的氣味，這是通過經由Ehrlich途徑還原由α-酮酸脫羧產生的醛而生成的[32]。此外，之前有報道稱，異戊醇和苯乙醇是發面饅頭和面包中最豐富的化合物[33-34]。

表2 不同發酵時間面團中醇類物質測定結果Table 2 Determination results of alcohol components in dough with different fermentation time

2.3.2 醛類化合物分析

醛類物質通常閾值較低，在面團混合和發酵過程中，亞油酸通過Ehrlich途徑被酶氧化，同時降解了一些氨基酸，最終產生了醛類物質[2]，如苯乙醛[27]。通常情況下，醛類物質在低濃度時對氣味起積極促進作用，而濃度較高時則變為異味的主要來源。由表3可知，未發酵面團檢出4種醛類物質，總含量為0.64 μg/kg；發酵6 h面團檢出1種醛類物質，總含量為0.04 μg/kg；發酵12 h面團檢出1種醛類物質，總含量為0.06 μg/kg；發酵18 h面團檢出2種醛類物質，總含量為0.61 μg/kg；發酵24 h面團檢出2種醛類物質，總含量為0.09 μg/kg。未發酵組中檢測出己醛、壬醛、癸醛、十二醛。24 h組檢出苯乙醛和椰子醛。根據文獻[21]報道，酵母中脫氫酶導致后期發酵面團中苯乙醛含量降低而苯乙醇含量明顯增加，苯乙醛可在醇脫氫酶作用下還原形成苯乙醇[35]，結果表明該酵母可能對此過程促進作用顯著。0h（未發酵組）中面團檢測到的己醛和壬醛，通常被認為是面粉中的異味化合物。后續發酵過程中，壬醛和己醛濃度降低，最終未檢測到這3種醛類，此結果同XI J等[36]的研究結果相同，在發酵過程中，造成壬醛和己醛含量降低的原因是發酵過程中脂質氧化[37]。證明產香酵母對面食風味的改善有積極作用。

表3 不同發酵時間面團中醛類物質測定結果Table 3 Determination results of aldehyde components in dough with different fermentation time

2.3.3 酸類化合物分析

由表4可知，未發酵面團檢出2種酸類物質，總含量為0.31 μg/kg；發酵6 h面團檢出2種酸類物質，總含量為0.50 μg/kg；發酵12 h面團檢出3種酸類物質，總含量為1.27 μg/kg；發酵18 h面團檢出3種酸類物質，總含量為2.17 μg/kg；發酵24 h面團檢出5種酸類物質，總含量為5.21 μg/kg。未發酵組中僅檢測的乙酸和正己酸。24 h組檢出乙酸、異丁酸、正己酸、2-甲基己酸和正壬酸。有機酸在發酵面食中起著重要的作用，不僅能產生酸的氣味，還能提供其他香味物質的前體。面團中檢測到的異丁酸、正己酸和正壬酸，為后續酯類的產生提供了前體物質。乙酸導致面團的酸味和酸氣。此外，乙酸是影響酸面團面包感官品質的最重要化合物之一，其在面包中的含量的變化表明了發酵劑發酵面團中微生物的差異。具有汗臭味的正己酸與不良風味物質形成有關[38]，發酵時間在12～18 h未檢測到正己酸。在生產中，有必要添加食用堿來中和面食中的酸味。

表4 不同發酵時間面團中酸類物質測定結果Table 4 Determination results of acid components in dough with different fermentation time

2.3.4 酯類化合物分析

由表5可知，未發酵面團檢出3種酯類物質，總含量為0.09 μg/kg；發酵6 h面團檢出10種酯類物質，總含量為1.12 μg/kg；發酵12 h面團檢出11種酯類物質，總含量為4.04 μg/kg；發酵18 h面團檢出10種酯類物質，總含量為8.12 μg/kg；發酵24 h面團檢出12種酯類物質，總含量為12.35 μg/kg。0 h組（未發酵組）檢測到少量酯類，發酵可以使面團中酯類含量顯著上升。24 h時達到最大，有持續增加的趨勢，這主要由占比最高的苯甲酸乙酯所主導，為花果味。酯類通常認為主要是由酸和醇的酯化反應產生[39]，能夠賦予面團特殊的果味和甜味。酯類是面食香氣的主要貢獻成分。乙酸苯乙酯由前體苯乙醇產生。經報道，正己酸乙酯經常在儲藏水果中被檢測到[40-41]，是一種具有果香的物質，為面團提供水果香氣。另外乙酸異戊酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸2-苯乙酯均為果香氣，不同類型的果香豐富了發酵面團的風味。

表5 不同發酵時間面團中酯類物質測定結果Table 5 Determination results of ester components in dough with different fermentation time

續表

2.3.5 其他類化合物分析

由表6可知，在不同發酵時間的面團中還檢測出烴類物質、酮類物質、醚類物質等其他類化合物。其中烷烴類化合物主要來源于脂質分解，十四烷烴、十五烷烴此類正構烷烴由面團中的脂肪產生。發酵過程中檢出的烯烴類物質有（E）-5-癸烯，烴類物質的閾值較高[42]，且大多烴類化合物香氣較弱或無味，但可能作為芳香類化合物的中間體，對風味的后續形成起基底作用。酮類通常是不飽和脂肪酸氧化而成[15]，其中甲基庚烯酮具有檸檬草和水果香氣[43]，香葉基丙酮具有甜木蘭花香[44]，對面團風味影響具有重要作用。烯烴類化合物可作為醛、酮類物質的前體物質對風味形成具有潛在作用[16]。發酵過程中還檢出少量環類物質，面團中含苯環類、雜環類化合物的相對含量較高，呈現出更濃郁的醇香、果香和堅果香味[45]。

表6 不同發酵時間面團中其他類物質測定結果Table 6 Determination results of other components in dough with different fermentation time

2.4 主成分分析

采用主成分分析法可以提取主要信息，直觀地反映5個樣本之間的8種含量＞1 μg/kg的化合物（乙醇、乙酸異戊酯、異戊醇、乙酸、辛酸乙酯、苯乙醇、異丁酸和苯甲酸乙酯）的特征，結果見圖4。由圖4a可知，前兩個主成分中PC1的方差貢獻率為91.2%，PC2的方差貢獻率為5.8%，PC1和PC2的累計方差貢獻率為97%，可以很好地反映5個樣品中主要風味物質的全部信息。未發酵組與發酵組樣品在產香上存在差異。未發酵組中含量＞1μg/kg的香氣物質較少。發酵0h（未發酵）、6 h和12 h組位于PC1的負半軸，PC1與發酵18 h和24 h組樣品呈正相關，與其他3個樣品呈負相關。PC2與發酵0 h（未發酵）、6 h和24 h組樣品呈負相關，與其他2個樣品呈正相關。由圖4（b）可知，發酵18 h組樣品位于第一象限，與乙醇、異戊醇、辛酸乙酯和苯甲酸乙酯的關聯緊密，異戊醇和乙醇是面包風味中的基本化合物。發酵24 h組位于第四象限，與苯乙醇、異丁醇、乙酸異戊酯、乙酸聯系緊密。在發酵后期乙醇含量較高可能與菌種有關。辛酸乙酯具有與白蘭地相似的風味，此類風味物質的檢出與文獻[42]結果類似。

圖4 不同發酵時間面團揮發性香氣化合物的主成分分析得分圖（a）和載荷圖（b）Fig.4 Principle components analysis score plot (a) and loading plot(b) of volatile aroma compounds in dough with different fermentation time

3 結論

在本研究中，產香酵母CGMCC NO.24005表現出良好的發酵能力和對溫度、pH的適應性。在不同發酵階段面團中總共發現了44種揮發性成分，其中8種揮發性香氣化合物的含量＞1 μg/kg。此酵母發酵面團的產物整體香氣較強，呈現出花果甜味；發酵組中酯類與醇類的多樣性及相對含量顯著高于0 h（未發酵）組（P＜0.05）。試驗結果表明，酵母菌株發酵24 h的面團，呈現果香、花香、酒香、甜香等特征明顯，其中乙醇、乙酸異戊酯、異戊醇、乙酸、辛酸乙酯、苯乙醇、異丁酸和苯甲酸乙酯是導致不同發酵時間產物呈現不同香氣特征的關鍵物質。在發酵面食中，酵母產生了與面食香味正相關的化合物，如異戊醇和苯乙醇。同時，降低了不良風味物質己醛。其余揮發性香氣物質增加了面團香氣的復雜性與獨特性。試驗研究結果表明，本實驗室保藏的酵母菌株可以提升傳統面食的風味品質，對實現面食的標準化生產，具有推廣應用潛力。