姜黃素通過調控NLRP3/Caspase-1信號通路改善腦缺血大鼠神經功能障礙*

張忠勝，黃曉敏，鄧小鳳

廣州醫科大學附屬第六醫院，清遠市人民醫院 廣東清遠 511518

急性腦梗死是最常見的急性腦血管病，死亡率和致殘率高。研究表明，炎癥是缺血后腦損傷的重要原因之一，因此，抗炎治療已成為缺血性腦損傷的一個新的治療方向。已有研究顯示，通過減少腦梗死大鼠腦組織中炎癥因子的含量及阻斷炎癥小體的激活，可以減少缺血腦組織細胞凋亡，促進大鼠的神經功能恢復[1-3]。姜黃素（curcumin）是從姜科姜黃屬植物的根莖中提取的一種植物多酚，是姜黃根莖的主要生物活性成分，具有抗病毒、抗纖維化、抗凝和葡萄糖調節功能等多種作用。姜黃素通過抑制 NF-κB和NLRP3炎癥小體抑制小膠質細胞/巨噬細胞焦亡來改善缺血性卒中小鼠模型的腦白質損傷[4]，而且，姜黃素在體內外均能促進神經元存活，發揮抗缺血損傷的作用[5-6]，以上研究均提示姜黃素對缺血性腦損傷具有神經保護作用。本實驗的目的是研究姜黃素治療對局灶性大腦中動脈閉塞（MCAO）大鼠模型的影響，并分析其潛在作用機制。

材料與方法

1 動物

SPF級健康雄性SD大鼠24只，體質量250～300g，由杭州醫學院提供，合格證號SCXK（浙）2019-0002。大鼠在20℃～22℃恒溫動物房中飼養，濕度（60±10）%，12h光照與12h黑暗交替，大鼠自由進食及飲水，造模前適應性飼養1周。

2 藥物與試劑

姜黃素（Sigma-Aldrich公司，批號PHR2209-50MG）；大鼠MCAO線栓（廣州佳靈生物技術有限公司，批號3600aaa）；2，3，5-三苯基氯化四氮唑溶液（Sigma-Aldrich公司，批號17779）；超敏化學發光檢測試劑盒（百賽生物，批號S6009M）；大鼠IL-1βELISA Kit（合肥萊爾生物科技，批號LE-B1145）；大鼠IL-18 ELISA Kit（合肥萊爾生物科技，批號LEB0380）；大 鼠NLRP3 ELISA Kit（Abcam公 司，批號ab277086）；BCA蛋白定量試劑盒（Thermo Fisher Scientific公司，批號23209）；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（大連美侖生物技術有限公司，批號MA0159）；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5X）（碧云天公司，批號P0015L）；HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG（H+L）（proteintech，批 號SA00001-1）；HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（proteintech，批 號SA00001-2）；TNF-a抗體（ImmunoWay，批號YT4689）Caspase-1抗體（proteintech，批號22915-1-AP）；P-caspase-1（Affinity，批號AF5438）；GAPDH（proteintech，批號60004-IIg）。

3 儀器

體視顯微鏡（上海永科公司，YKT-5300）；超低溫冷凍儲存箱（中科美菱，DW-HL340）；移液器（德國eppendorf，L10577G）；離心機（中國白洋，B320A）；微量冷凍離心機（貝克曼，Microfuge-22R）；數顯恒溫水浴鍋（上海邦西儀器科技有限公司，HH-52）；蛋白垂直電泳儀（美國BIO-RAD公司，POWER PAC 200）；軌道式搖床（杭州米歐儀器有限公司，GS-20）；化學發光成像系統（美國BIO-RAD公司，ChemiDoc Touch）；酶 標儀（美國BIO-RAD公司，680型號）；電子分析天平（賽多利斯，BS224S）；磁力攪拌器（MYP13-2S，上海梅穎浦儀器公司）

4 造模與給藥

SD大鼠于室溫下適應性飼養1周，根據隨機數字表法將24只SD大鼠隨機分為3組：假手術組（Sham組），MCAO大鼠模型組（MCAO組）和姜黃素干預組（CUR組），每組8只。Sham組大鼠頸內動脈僅被隔離，但不插入尼龍縫線栓塞大腦中動脈。模型制備參考改良Zea-Longa線栓法[7]。缺血60min后拔出線栓，模型建立后即刻對大鼠進行腹腔注射1次姜黃素（100mg/kg），隨后連續6天每日接受腹腔注射1次（100mg/kg），假手術組和模型組組在相同時間點腹腔注射等量生理鹽水；建模后第14d將各組大鼠處死取腦。

5 神經功能評分

采用Longa 評分法對大鼠進行神經功能評分[7]，評分在2～3分的大鼠被納入實驗。0分：沒有神經損傷的癥狀；1分：不能完全伸展對側前爪；2分：大鼠向對側轉圈；3分：向對側傾倒；4分：不能自行行走，失去意識。在造模后第1d、7d、14d對各組大鼠進行神經功能評分。

6 TTC 染色法測定各組大鼠腦梗死體積

將大鼠斷頭取腦后用鹽水洗滌，將腦組織在-20℃冷凍20min，制作厚度2mm的腦組織冠狀切片，在37℃溫度下用2%TTC染色30min，隨后用4%甲醛溶液固定。OLYMPUS數碼相機采集圖像，使用Image-proplus 6.0軟件分析圖片，計算病灶側腦梗死體積及與總體積的百分比（病灶側梗死體積=梗死面積×腦片厚度。梗死體積百分比=（病灶側梗死體積/對側半球體積）×100%）。

7 ELISA法檢測大鼠腦組織中IL-18、IL1β及NLRP3含量

于造模后第14d處死大鼠，斷頭取腦，沖洗稱重。稱量后制備腦組織勻漿。按照各試劑盒說明書操作進行，通過ELISA法測定腦組織勻漿中IL-18、IL1β及NLRP3含量。

8 Western blot法檢 測TNF-α、Caspase-1及P-Caspase-1表達

造模14d后，用10%水合氯醛麻醉處死大鼠，斷頭取腦，取腦梗死組織加PBS研磨，用預冷的組織裂解液提取腦組織總蛋白，Bradford法測定樣品蛋白含量。蛋白變性、上樣，十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳1 h，濕法轉膜45 min。脫脂奶粉封閉2 h，洗膜后與稀釋的TNF-α、Caspase-1及P-Caspase-1一抗溶液孵育，4℃搖床過夜；洗滌，加入二抗溶液室溫下孵育1 h。膜上滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統中曝光。用“Quantity one”軟件分析各抗體條帶灰度值。

9 統計學處理

結 果

1 大鼠神經功能評分

與Sham組相比，MCAO組和CUR治療組大鼠在造模1d、7d、14d神經功能評分顯著升高（P＜0.05）；與MCAO組相比，CUR治療組大鼠神經功能評分在造模1d、7d無顯著變化（P＞0.05），在造模14d神經功能評分顯著降低（P＜0.05）。見表1。

表1 不同組別大鼠神經功能評分（±s）

表1 不同組別大鼠神經功能評分（±s）

注：與Sham組比較*P＜0.05，與MCAO組比較#P＜0.05

組別 造模前 神經功能評分造模后1d 造模后7d 造模后14d Sham組 0 0 0 0 MCAO組 0 2.83±0.41* 2±0* 1.5±0.55*CUR組 0 2.67+0.52* 1.83±0.41* 0.83±0.41*#

2 TTC染色計算大鼠腦梗死體積

通過TTC染液對各組大鼠腦組織進行染色。結果如圖1所示：Sham組大鼠腦切片TTC染色未見梗死灶出現； CUR組為（27.75±3.44）%，低于MCAO組的（39.05±3.54）%，差異有顯著性（P＜0.05）。見圖1，圖2。

圖1 TTC染色法比較不同組別大鼠腦梗死體積

圖2 不同組別大鼠腦梗死體積比較

3 大鼠腦組織中IL-18、IL1β及NLRP3含量

按照試劑盒說明書進行含量測定，通過ELISA檢測的方法對各組大鼠腦組織檢測，檢測結果如表2所示。與假Sham相比，MCAO組IL-18、IL-1β、NLRP3的含量明顯上升（P＜0.05）；與MCAO組相比，CUR治療組IL-18、IL-1β、NLRP3的含量降低，比較差異有顯著性（P＜0.05）。見表2。

表2 不同組別大鼠腦組織IL-18、IL-1β、NLRP3含量（pg/mL-1）

4 大鼠腦組織TNF-α、Caspase-1及其磷酸化表達

通過WB檢測方法對各組大鼠腦組織檢測，檢測結果如圖3、圖4、圖5所示，與Sham組相比，MCAO組腦組織中TNF-α、caspase-1、P-caspase-1的蛋白表達水平明顯上升（P＜0.05）；與MCAO組相比，CUR組中TNF-α、caspase-1、P-caspase-1的蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）。

圖3 不同組別大鼠腦組織IL-18、IL-1β、NLRP3含量比較

圖4 不同組別大鼠腦組織TNF-α、Caspase-1、P- Caspase-1表達水平（Western-Blot）

圖5 不同組別大鼠腦組織TNF-α、Caspase-1、PCaspase-1表達水平比較

討 論

急性腦梗死是最常見的腦卒中類型，當前研究表明，急性腦梗死會導致神經元細胞死亡和損傷相關分子模式（DAMP）等因子的釋放，這些因子會在受損傷的大腦區域立即引發局部炎癥[8]，通過加劇血腦屏障損傷、微血管衰竭、腦水腫、氧化應激和直接誘導神經元細胞死亡而加重繼發性腦損傷。除了局限于受損大腦區域的炎癥外，中風后的炎癥反應也會發生并持續整個大腦，影響患者的長期預后[9]。因此，炎癥在腦卒中的發病機制中扮演著重要角色，抗炎治療對卒中防治具有重要意義[10-11]。

腫瘤壞死因子α（TNF-α）具有炎癥和代謝作用。Lin等發現[12]，使用TNF-α受體抑制劑R-7050預處理永久性腦缺血大鼠模型，可以減輕卒中后大鼠的神經功能缺損、腦梗塞、腦水腫及氧化應激水平，這提示降低TNF-α水平對腦缺血損傷有保護作用。NLRP3（含NOD-、LRR-和pyrin結構域的蛋白質3）是一種細胞內傳感器，可檢測多種微生物、內源性危險信號和環境刺激物，從而導致NLRP3炎癥小體的形成和激活，NLRP3可以介導caspase-1激活，調控下游炎癥因子IL-1β/IL-18 等的釋放[13-14]，Zhang等[15]研究表明，重組骨橋蛋白可以減少缺血性梗死面積并減輕大鼠腦缺血性損傷，這可能與其有效參與抑制炎癥小體和小膠質細胞炎癥激活有關。胡興等[16]發現，NLRP3炎癥小體信號通路在缺血缺氧性腦損傷新生大鼠海馬組織中表達增高，可能導致缺血缺氧性腦損傷新生大鼠神經細胞死亡。Zhu等[17]和Li等[18]研究發現，降低NLRP3炎癥小體的激活，可以改善缺血性中風模型小鼠的神經功能評分，減少腦梗死面積并改善腦水腫。以上研究說明，抑制NLRP3炎癥小體及其下游分子，可能是未來神經保護治療的潛在靶點。

姜黃素是姜黃中的一種多酚，據報道具有抗氧化、抗炎、保肝、抗動脈粥樣硬化和抗糖尿病等特性[19-21]。近年來，姜黃素應用在神經系統領域的研究日益增多，包括阿爾茨海默病、帕金森病、多發性硬化癥、亨廷頓病、朊病毒病、中風、肌萎縮側索硬化癥等疾病[22-25]。在本研究中，我們使用大腦中動脈閉塞方法建立了大鼠局灶性腦缺血模型，并用姜黃素對其進行干預。采用神經功能評分法、TTC染色法、酶聯免疫吸附法和Western blot法研究姜黃素對大鼠神經功能、腦缺血損傷、炎癥因子IL-1β、IL-18、TNF-α、caspase-1以及炎性小體NLRP3表達的影響。結果顯示，與缺血模型組相比，姜黃素可以改善大鼠神經功能評分，減少腦梗死體積，顯著降低大鼠梗死腦組織中IL-1β、IL-18、TNF-α水平，提示姜黃素很可能通過抑制炎癥反應，減輕大腦炎癥損傷。而IL-1β、IL-18的釋放是caspase-1依賴性的，需要經過caspase-1的剪切活化。而NLRP3/Caspase-1是IL-1β、IL-18等炎癥因子的上游通路，阻斷NLRP3/Caspase-1信號通路，可以減輕炎癥因子合成與釋放，減輕組織炎癥損傷與細胞凋亡[26-28]。本研究顯示，腦缺血模型組大鼠腦組織中NLRP3、Caspase-1的蛋白表達顯著增高，姜黃素治療組NLRP3、Caspase-1顯著下降，推測姜黃素通過抑制NLRP3/Caspase-1信號通路，減少IL-1β、IL-18的釋放。

我們的研究表明，姜黃素可以減少大鼠腦梗死面積并改善神經功能，這可能與其減輕炎癥反應有關，其抗炎機制可能與姜黃素阻斷NLRP3/Caspase-1信號軸，抑制NLRP3炎癥小體的功能，減少炎癥因子的合成與釋放有關。