強心安神方對慢性心衰大鼠心肌細胞凋亡的保護作用 及機制探討*

卿媛媛，李茹，王芳婷，陶源，張婷，莊紅，顏旭

1 湖南中醫藥大學 湖南長沙 410208

2 湖南省中醫藥研究院附屬醫院 湖南長沙 410006

心力衰竭（ChronicHeartFailure，CHF）是心血管疾病進展至末期的病理表現。我國目前的心衰患者高達 890 萬，而且有30%～35%的住院病人同時伴有CHF，心衰的再住院率占心血管事件的16.7%，雖然目前心衰患者死亡率呈明顯下降趨勢，但再住院率仍在增加[1-2]。因此改善心衰患者的預后及降低再住院率是極期重要的臨床工作。課題組前期實驗研究發現強心安神方可抑制神經內分泌因子及腎素-血管緊張素系統過度激活、改善心肌細胞線粒體呼吸功能與COX活性，改善心肌細胞能量代謝有關，可能存在其他作用機制[3-6]。本實驗以強心安神方對心衰大鼠進行干預治療，觀察大鼠心臟彩超左室射血分數（LVEF）值、左室收縮率（LVFS）值及心肌細胞凋亡情況，觀察心肌細胞凋亡標志性蛋白CHOPmRNA、GRP78mRNA表達的差異，探索其治療心力衰竭的作用機制。

材料與方法

1 實驗動物

湖南中醫藥大學動物中心Wistar雄性大鼠共60只，平均體質量約200g左右。

2 主要儀器與試劑

熒光PCR儀（型號：CFX Connect?實時，廠家：伯樂生命醫學產品（上海）有限公司）小動物超聲影像（型號：Vevo2100，廠家：VisualSonics）微型離心機（型號：D1008E，SCJLOGEX）；旋渦混合器（型號：XH-C，廠家：常州越新儀器制造有限公司）等。鹽酸阿霉素購于深圳萬樂藥業有限公司（生產批號：1812E1）；卡托普利購于華中藥業股份有限公司（生產批號：20161101）；湖南春光九匯有限公司提供強心安神方超微顆粒（炙黃芪 10g，酸棗仁15g，黃連3g，肉桂2g，阿膠6g，五加皮10g，制首烏10g，葶藶子5g，三七3g）；UltraSYBR Mixture出自CWBIO 康為世紀（生產批號：CW0957M）；蘇木素染液（生產批號：ZLI-9610，品牌：中衫金橋）；伊紅染色液出自Solarbio品牌（生產批號：G1100）；Scott藍化液出自Solarbio品牌（生產批號：G1865）。

3 實驗方法

3.1 模型制備 參照文獻[7]報道采用鹽酸阿霉素（ADR）腹腔注射進行造模，第1～3周按照3mg/kg 劑量對大鼠進行腹腔注射，第4～6周則按2mg/kg劑量進行腹腔注射，1次/周；按1周1次的頻率給藥，每天觀察大鼠的精神狀態及行為學改變情況，給藥連續6周后，根據大鼠心臟超聲結果以及NT-proBNP水平，以判斷造模是否成功。

3.2 實驗分組及給藥 將60只Wister大鼠分為正常對照組9只，造模組51只，從造模成功后的大鼠中隨機抽取36只并隨機分為CHF 模型組（等量滅菌蒸餾水，Model）、卡托普利組（2.7mg/kg，Captopril）、強心安神方小劑量組（0.16g/kg，Small dose）、強心安神方大劑量組（0.64g/kg，Large dose），每組大鼠各9只。各組括號內藥物劑量按照人體與動物等效劑量系數換算得出，每組按照每天一次的頻率灌胃給藥，4周后可觀察一般情況，用于后期心臟彩超、心肌細胞凋亡情況及內質網應激特異性蛋白GRP78、CHOP的檢測。

4 觀察指標

4.1 心肌細胞凋亡檢測（TUNEL 法） 取大鼠左心室游離壁中間的心室肌肉，浸入 4%多聚甲醛溶液中，固定 24 h后，經過各級乙醇溶液進行脫水處理，放入石蠟和二甲苯按照1：1配制的混合液中15min，再依次放入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ透蠟50min左右，予以石蠟包埋繼而切片后進行烤片，然后進行脫蠟、水化處理后，放入蘇木精水溶液中染色3min，鹽酸乙醇分化液分化15s，稍行水洗后，返藍液返藍15s，流水沖洗5min，再置入伊紅染色3min，繼續用流水沖洗5min，再次進行脫水、透明、封片后鏡下檢測觀察病理情況。

4.2 心臟功能檢測 應用小動物超聲影像測量大鼠左室射血分數（LVEF）及左室收縮率（LVFS）。

4.3 內質網應激標志性基因GRP78、CHOP mRNA檢測 在濕度55%，溫度21℃的實驗室內，采用Real Time-PCR法，TRIZOL 法提取總RNA，按Fermetas 公司逆轉錄試劑盒操作逆轉錄為cDNA，后進行PCR 擴增，退火溫度分別為：58.2℃、58.6℃、56.5℃，用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析系統進行拍照并對DNA目條帶掃描處理，基于GAPDH內參分析各基因與之相對應的表達水平。見表1。

表1 引物信息表

5 統計學方法

使用SPSS26.0軟件進行數據處理及統計分析，計量資料均采用（±s）表示。多組間數據分析采用單因素方差分析，兩組間比較采用最小顯著差數（LSD）法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 心肌組織病理學

正常組心肌排列有序，組織有輕微腫脹充血，模型組心肌排列紊亂，肌漿呈凝固性壞死或空泡，細胞核固縮甚至破裂，與模型組比較強心安神方小劑量組、強心安神方大劑量組、卡托普利組心肌排列整齊致密，其中強心安神方大劑量組、卡托普利組效果更好。見圖1。

圖1 心肌組織HE染色結果（HE×400）

2 心功能超聲檢測

與正常對照組相比，模型組、強心安神方小劑量組、強心安神方大劑量組及卡托普利組的EF、FS均顯著降低，P＜0.01，差異有統計學意義。見表2。

表2 各組大鼠彩超結果比較

3 RT-PCR檢測GRP78 mRNA、CHOP mRNA比較

與正常對照組相比，模型組、強心安神方小劑量組、 強心安神方大劑量組、卡托普利組GRP78 mRNA表達均升高（P＜0.05）；與模型組相比，強心安神方大劑量組GRP78 mRNA表達降低（P＜0.05）；與正常對照組相比，模型組、強心安神方小劑量組、 強心安神方大劑量組、卡托普利組CHOPmRNA表達升高（P＞0.05）；與模型組、對照組相比，卡托普利CHOPmRNA表達升高（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組RT-PCR檢測GRP78 mRNA、CHOP mRNA

討 論

“慢性心力衰竭”可歸屬于中國古代醫學的“喘證”“水腫”“胸痹”等范疇，其主要病機可概括為“虛”“瘀”“水”，病位在心，與它臟均密切相關，病理產物主要為“瘀血”“痰濁”“水飲”，臨床上以“益氣養陰溫陽”法治其本，“活血利水”法治其標可取得良好療效[8]?！皬娦陌采穹健币灾它S芪為君藥，取其補氣升陽、利水消腫、行滯通痹之功效，方中制首烏補肝腎、益精血，二藥合用益氣養陰溫陽，使陰陽相交，共奏強心安神之效；取三七活血消腫、大黃逐瘀利濕通腑之效，葶藶子善入肺經而平喘并利胸脅之水協同五加皮利水消腫，共為臣藥以化瘀利水；黃連、肉桂配伍以交通心腎，阿膠養血生津，加之酸棗仁四藥可除煩熱、安心神。以上藥物組成可益氣養陰溫陽，強心安神。

心力衰竭的不斷進展以心室重構為生理病理基礎，而心肌細胞的過度凋亡是心室重構的典型表現，其貫穿于心衰發生發展的始終。細胞凋亡是在內在基因調控下的細胞自主的有序死亡，心肌細胞的過度凋亡可以引起心臟收縮單位的減少進一步導致心室重構[9]。本研究采用鹽酸阿霉素腹腔注射誘導心肌細胞凋亡的心力衰竭大鼠模型，結果顯示，正常對照組組織有輕微腫脹充血，心肌排列整齊；模型組心肌細胞凋亡最明顯；與模型組比較強心安神方小劑量組、強心安神方大劑量組、卡托普利組心肌細胞壞死程度明顯減輕，這表明強心安神方以及卡托普利對于心肌細胞具有保護作用，可抑制心肌細胞的凋亡。相比于對照組，模型組、強心安神方小劑量組、強心安神方大劑量組、卡托普利組的LVEF、LVFS均顯著降低，P＜0.01，雖然強心安神方小劑量組、大劑量組以及卡托普利組大鼠LVEF以及LVFS相比較模型組有所提高，但差異不明顯，不具有統計學意義。結合前期研究成果及文獻考慮可能阿霉素造模大鼠心臟毒性大，經6周造模后，大鼠心臟結構改變，而本實驗僅用藥物干預4周，藥效還不足以使心臟結構恢復。

內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）作為細胞凋亡的主要通路之一，其介導的心肌細胞凋亡與心衰的發生發展及預后密不可分，葡萄糖調節蛋白78（glucose-regulatedprotein78，GRP78）是內質網的特異性伴侶蛋白，內質網應激時GRP78的表達上調，與跨膜蛋白解離轉而與內質網未折疊蛋白結合，可有效抵抗細胞應激，類似于代償性的抑制內質網應激的信號表達，進而抑制細胞凋亡，但是隨著GRP78的過度上調不能維持內質網的穩態，則會激活內質網的下游信號分子C/EBP同源蛋白（C/EBP homolo-gous protein，CHOP），進一步誘導細胞凋亡[10-12]，所以GRP78、CHOP蛋白的上調可以作為內質網應激的標志。故本實驗通過采用Real Time-PCR法檢測GRP78 mRNA、CHOP mRNA的表達，與正常對照組相比，模型組GRP78 mRNA表達升高（P＜0.05）；與模型組相比，強心安神方大劑量組GRP78 mRNA表達降低（P＜0.05），實驗表明強心安神方大劑量組可以抑制GRP78 mRNA的表達，達到抑制內質網應激從而改善心肌細胞凋亡；與正常對照組相比，模型組、強心安神方小劑量組、 強心安神方大劑量組、卡托普利組CHOPmRNA表達均升高（P＞0.05）；與模型組、對照組相比，卡托普利CHOPmRNA表達升高（P＜0.05），結果顯示各實驗組CHOPmRNA表達無統計學意義，強心安神方抑制內質網應激可能與CHOPmRNA表達無相關性。

綜上所述，實驗證實強心安神方可以改善心衰大鼠心功能，在一定程度上抑制心肌細胞凋亡，其機制可能與調控GRP78 mRNA抑制內質網應激相關，但是否與調控其他內質網應激標志性蛋白的表達還需進一步研究。