毒性病理學方法與技術在毒理學試驗中的應用

胡楚元，詹麗超，朱嘯川

（湖南省職業病防治院，湖南長沙 410007）

毒性病理學是研究藥物在不同劑量作用下，從組織病理學水平上探究受試動物的病變原因、發病機制、組織形態改變以及由此而引起的結構功能變化的學科[1]。毒性病理學技術和方法不僅應用于藥物安全性評價，而且廣泛應用于食品（保健食品）、農藥、化學品等的安全性評價，食品的功能性評價檢驗，以及所有利用各種實驗動物的科學研究。科學管理和規范化操作是確保毒性病理學方法與技術精準實施的關鍵。

1 毒性試驗染毒方式及注意事項

1.1 染毒方式

①經口灌胃染毒方式，使用大鼠灌胃針灌胃，一次性完成單次受試物的給予，動物每天經口染毒1次；②經皮染毒方式，以不同劑量受試物每日分別涂布實驗動物皮膚上；③吸入染毒方式，將受試物制備成特定濃度的氣態、氣溶膠或顆粒狀物混懸態，以動式染毒系統重復染毒等。

1.2 注意事項

（1）染毒操作時應充分考慮動物的利益，善待動物，防止或減少動物的應激、痛苦和傷害，制止針對動物的野蠻行為。

（2）實驗人員需崗前培訓，持證上崗，操作技術規范。

（3）保障實驗動物的福利倫理，成立動物倫理委員會并進行實驗動物福利和動物倫理的審核[2]。

2 實驗動物的剖檢

2.1 解剖要求

應對計劃剖檢的全部動物進行全面的大體解剖學檢查，剖檢時應快速、全面、完整、精細。

2.2 解剖注意事項

（1）解剖前項目負責人應召集相關實驗人員安排準備工作，確定解剖人員，明確解剖方案。

（2）了解受試物信息，盡可能明確靶器官；核對動物信息，包括項目編號、動物號、動物性別、劑量組、數量等。

（3）準備解剖器械，如剪刀，鑷子，止血鉗，解剖板等。

（4）準備固定臟器的容器并貼好標簽，配制10%中性福爾馬林溶液用來固定組織。

（5）準備解剖所需的記錄表格及異常臟器照相裝置。

（6）解剖前對動物進行體表檢查，包括發育狀態、營養狀況、精神狀態、呼吸系統、消化系統、被毛、皮膚等。

（7）準備麻醉用具：根據試驗要求，選擇合適的安樂死模式，如乙醚麻醉、10%水合氯醛麻醉、CO2安樂死等。

（8）準備采血用具，包括抗凝管、離心管、采血針等并做好標記，并選擇合適的采血方式，如腹主動脈采血。

2.3 大鼠系統解剖要求及方法

（1）大鼠系統解剖的一般檢查。主要檢查動物外觀，包括體形、被毛和皮膚、外生殖器及各腔道；按照順序打開腹腔、盆腔、胸腔和顱腔，觀察各臟器在體位置、顏色、質地、有無出血及有無積液、粘連等[3]。

（2）按照試驗方案摘取所需的組織和器官，一般來說組織病理學檢查包括腦、心臟、主動脈、食道、肺臟、氣管、胸腺、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、肝臟、脾臟、腎臟、腎上腺、胰臟、甲狀腺、甲狀旁腺、有代表性的淋巴結、脊髓（頸、胸、腰段）、坐骨神經、胸骨、膀胱，雄性大鼠的睪丸、附睪、前列腺及精囊，雌性大鼠的卵巢、子宮及陰道。

（3）根據試驗要求，對相應臟器進行稱重，需稱重的臟器，其表面的脂肪或筋膜要剔除干凈，以免影響臟器重量，導致試驗結果不準確；小臟器如腎上腺、垂體等容易丟失，稱重后可直接放到預先準備好的包埋盒中。

（4）留取的組織標本應盡可能塊的浸放到固定液中，解剖時應注意力度，避免用力過度損傷臟器，影響后期的組織病理學檢查結果。

3 病理學技術在毒理學試驗中的應用

3.1 病理工作一般流程

3.1.1 預約登記、標本驗收

（1）項目負責人填寫《病理組織學檢查申請表》。

（2）病理檢查人員與項目負責人共同核對樣本信息，如樣本數量、組織類型等。

（3）病理檢查人員填寫《病理組織學檢查登記表》。

3.1.2 取材

按照毒理試驗病理組織學取材SOP 進行取材，并及時填寫《毒理試驗組織標本取材記錄表》。組織標本規范化取材舉例如下。

3.1.2.1 脾臟

中部橫切取一塊，厚度約為2.5mm。

圖1 病理工作一般流程

圖2 脾臟取材位置

3.1.2.2 肝臟

橫切中間葉，縱切左葉，各取一塊，厚度為2～3mm，長寬度分別為0.5cm×1.0cm。

圖3 肝臟取材位置

3.1.2.3 腎臟

組織取材時，應對左右腎分別進行取材，左側橫切，右側縱切，含乳頭部各取一塊，取材厚度為2.5mm。

圖4 腎臟取材位置

3.1.2.4 心臟

去掉心臟基部血管（橫切去除），將切面朝下，沿心臟縱切面最大截面方向取心肌，含左右心房，左右心室，厚度約為2.5mm，大小為0.8cm×0.8cm。

圖5 心臟取材位置

3.1.2.5 肺臟

取肺左葉近肺門部組織，橫切取一塊，大小約為2.5mm×0.5cm×0.8cm。

圖6 肺臟取材位置

3.1.3 脫水與包埋

取材后將組織放到脫水盒中(圖9、圖11)，進行規范化脫水處理及包埋（圖7、圖8、圖10），并及時填寫《毒理試驗組織標本脫水記錄表》 和《毒理試驗組織標本包埋記錄表》。

圖7 櫻花全自動脫水機

圖8 櫻花全自動包埋機

圖9 組織取材包埋盒

圖11 標本編號

3.1.4 切片與染色

使用（圖12）輪轉式切片機對已包埋的組織進行切片操作，切片前準備鋒利的一次性刀片，將包埋塊夾在切片機持塊架上，調節角度使其合適，然后轉動切片機。使蠟塊切面與刀刃平行。切片時，先對蠟塊進行粗修使組織平面完全暴露，再進行組織切片。組織切片后需進行1～2h 時烘烤，使組織與載玻片粘貼牢固后方可進行常規HE 染色[4]，使用（圖13）櫻花自動染色機及自動封片機按預先設定好的程序進行規范化高通量自動染色與封片。上述操作完畢后應及時填寫《毒理試驗組織標本石蠟切片記錄表》 和《毒理試驗組織標本染色記錄表》。

圖12 輪轉式切片機

圖13 櫻花全自動染色機

3.1.5 毒理學試驗中的組織病理學檢查

3.1.5.1 組織病理學檢查原則

（1）先對最高劑量組和對照組的動物標本以及剖檢中發現異常的標本進行組織病理學檢查。

（2）發現高劑量組動物器官和組織有病變后再對中、低劑量組動物相應器官和組織進行組織病理學檢查。

（3）對大體解剖時發現異常的組織臟器進行組織病理學檢查；染毒處理組有異常改變的，應對恢復觀察期動物相應的器官和組織進行組織病理學檢查。

（4）試驗過程中死亡或瀕死動物，應對全部保留的組織和器官進行組織病理學檢查[5]。

3.1.5.2 組織病理學評價流程

鏡檢前病理學家應該獲得的必要信息，包括如下部分：①化學品的特性以及該類物質已知的活性；②該化學品前期的毒性研究結果；③毒理學試驗設計的資料；④動物的個體數據（臨床癥狀、體重的變化、食物消耗等）；⑤血液學、臨床生化以及尿液分析結果；⑥個體動物的剖檢（大體）改變必須提供給病理學家[6]，以上信息對于確定靶器官和認識毒性機制有一定的幫助作用。病理學家還應該了解臟器重量的改變，因為通常組織病理學的改變與臟器重量的改變相關聯。

病理學家應該使用標準化的診斷術語和診斷標準，術語應該能夠清晰地描述組織病變的特點。如果簡單的術語不能很好地描述復雜的病理改變，應使用詳細的文字描述對病理結果進行解釋。此外，適當地進行同行評議能增加研究中組織病理學改變正確判斷的可靠性。

3.1.5.3 組織病理學檢查中的數據歸檔

鏡檢原始記錄，病理報告，病理影像（電子圖片或數碼照片）原始數據，病理標本（蠟塊或玻片）必須歸檔；同行評議過程中對原病理結果產生改動時需提供一份病理修訂報告，也應依據要求進行歸檔[7]。

4 毒性病理學技術中的生物安全

在毒性病理學試驗操作過程中會使用大量的甲醛、二甲苯、酒精、松節油等有害化學物，具有較強的揮發毒性和刺激性，有的甚至具有強致癌性，不僅容易對病理實驗人員產生身體傷害，對環境污染也不容小覷。生物安全是實驗室安全工作的重點之一，病理實驗室應優化實驗室空間布局，加大生物安全防護設備的投入力度，設置清潔區，半污染區和污染區[8]。根據實際情況制定病理實驗室生物安全制度，建立生物安全意識，避免實驗室感染，防止實驗室事故發生。實驗人員必須進行相關生物安全知識、法規培訓，進一步強化職業安全防護意識與防護技能。化學性廢物應根據其腐蝕性和毒性分類存放，實驗室應統一用廢液桶收集，由專業的廢液處理公司處置。實驗人員要把生物安全防范作為一個長期的工作來做，才能確保毒性病理學試驗過程中每個環節的安全，最大程度地避免生物安全事故的發生。

5 小結

毒性病理學試驗方法與技術在毒性病理學診斷中具有重要意義，毒性病理診斷的準確性和可靠性對毒理學試驗具有非常重要的指導意義，也將影響毒理學試驗的發展。隨著時代發展和科技進步，毒性病理學規范化平臺逐步建設，實驗室儀器設備更新換代，毒性病理技術的規范化操作水平不斷提高，將為毒理學試驗提供充分的保障，在促進我國毒性檢測事業蓬勃發展的同時，也將逐漸縮小我國毒性病理學與世界發達國家和地區的差距。