一例貉源細小病毒病的診斷與防治

伊 惠，曹 兵

（1.山東省泰安市畜牧獸醫事業發展服務中心，山東泰安 271000；2.滕州市畜牧漁業事業發展中心，山東棗莊 277500）

貉細小病毒可以引起貉出現嚴重的腸炎癥狀，包括嘔吐、排血樣糞便、精神沉郁、厭食等。在幼貉群體中常常出現地方性流行的特點，而在成年貉群體中感染后呈現多種隱性或慢性感染。該病在每年的6—9月多發，主要的傳染源為患病貉，即使康復后自身攜帶免疫力，仍然可以向環境排毒，健康貉通過呼吸道和消化道感染。1988 年，夏咸柱等[1]在不同地區分離鑒定了3 株貉細小病毒，首次證實了我國存在貉細小病毒。近年來在山東地區貉細小病毒也有相關報道。2016，于佳玉等[2]在泰安地區分離鑒定了3 株貉細小病毒，系統進化分析屬于CPV-2 型；2020 年，葛向平[3]在山東某貉養殖場分離到一株貉細小病毒，同樣屬于CPV-2 型。本研究通過實驗室診斷，鑒定分離到一株貉源細小病毒，并為養殖場制定了針對性的防治措施，為貉源細小病毒的實驗診斷與預防治療提供參考。

1 病例的發病情況介紹

在山東省泰安市某貉養殖場，患病貉出現精神沉郁，嘔吐、腹瀉等腸炎癥狀，剖檢后觀察到腸黏膜出血，腸系膜淋巴結出現水腫充血。根據患病貉的臨床癥狀結合剖檢病變，初步懷疑該病例為細小病毒感染，為進一步確定病原，需進一步進行實驗室診斷。

2 病毒分離培養與鑒定

2.1 病毒分離培養

采集患病貉的糞便加入總體積90%的生理鹽水，制備成懸液。12000r/min 離心10min，取上清加入等體積的氯仿，再次12000r/min 離心10min，吸出氯仿既為病毒液。用0.22mm 濾器進行過濾除菌后按照同步接種的方式，以5%比例接種于CRFK 細胞中，培養72h，觀察是否有病變，若無明顯病變，將細胞凍融3 次后，從新接入生長良好的細胞中，按此方法盲傳3 代后觀察病變。F3 代培養48h 后細胞出現圓縮、拉絲、脫落等明顯病變，如圖1A 所示。而正常的對照細胞狀態良好，如圖1B 所示。

圖1 CRFK 細胞病變情況

2.2 細胞半數感染量（TCID50）測定

取病變明顯的F3 代細胞培養病毒液反復凍融3次，按照10 倍稀釋法進行103～108稀釋，將稀釋好的病毒接種于CRFK 細胞96 孔培養板中，每孔加入0.1mL 病毒稀釋液，每個稀釋度重復8 個孔，放入CO2培養箱中培養72h，觀察病變并記錄有病變的孔數，按照ReedMuench 法進行TCID50 的計算。測得該細小病毒分離株的TCID50 為10～5.5/0.1mL。

2.3 豬紅細胞凝集試驗

在血凝板中加入25μL 的PBS，在第1 個孔中加入待測的病毒液，依次倍比稀釋之第11 孔，棄去，第12 孔為陰性對照。在每個孔中加入1%的豬紅細胞，震蕩混勻后放置到4℃冰箱中，作用1h 后觀察結果。結果顯示該細小病毒分離株3～6 代病毒培養液的血凝效價基本穩定在28。

2.4 PCR 擴增試驗

把病毒液煮沸5min，然后冰上放置5min 后以此為DNA 為模板進行PCR 擴增，反應體系為：10×PCR buffer：2.5μL；dNTP：2μL；上下游引物：0.5μ L；rTaq：0.5μL；加ddH2O 至25μL。反應條件如下：95℃預變性3min；95℃變性30s；55℃退火30s；72℃延伸30s；30 個循環后72℃延伸10min。取PCR 產物5μL 進行瓊脂糖凝膠電泳。引物序列如下：F：5'-GCTACTCAGCCACCAACT-3'；R：5'-TAAGCCCAATGCTCTATT-3'。經過PCR 擴增后凝膠電泳觀察結果，如圖2 所示，出現預期300bp 大小的特異性條帶，結果表明，該分離毒株為貉細小病毒。

圖2 PCR 擴增結果

2.5 間接免疫熒光試驗

將生長狀態良好的CRFK 細胞，消化傳代后加入到6 孔細胞培養板中，每孔加入2mL，CO2培養箱中培養24h 后，每孔加入40μL F3 代病毒細胞培養液，作用3h 后使用預冷的PBS 洗滌細胞3 次，加入100μL 4%多聚甲醛（PFA）固定液，室溫固 定15min，用PBS 洗滌殘留的固定液后，用0.25%Triton X-100 處理細胞20min，PBS 洗去通透溶液，把抗CPV-2 型VP2 蛋白的一抗按照1∶400 比例稀釋到PBS 溶液中，加入稀釋好的一抗后放置4℃冰箱孵育過夜，用PBS 溶液洗滌細胞3 次，以去除多余的抗體。再使用TRITC 標記的二抗按照1∶500 比例稀釋到PBS 溶液中，加入稀釋好的二抗室溫孵育1h。用PBS 洗滌去除殘留的抗體。進行熒光顯微鏡下觀察。如圖3 所示：在接種F3 代病毒組可以觀察到特異性綠色熒光，而正常的細胞對照組沒有綠色熒光。

圖3 間接免疫熒光結果

3 防治措施

3.1 加強養殖場的飼養管理

對死亡的貉進行無害化處理，對養殖舍、籠具進行全面消殺；把患病的貉隔離飼養。

3.2 緊急接種疫苗

對養殖場每只貉接種5mL 水貂腸炎滅活疫苗。

3.3 藥物治療

按照患病貉體重每日兩次皮下注射鹽酸嗎啉4mL，阿托品2mL，慶大霉素5mL；同時飼料中添加維生素C、益生菌輔助治療。連續治療5d 后，患病貉的病情得到有效控制。

4 討論

貉作為細小病毒的易感動物，近幾年在山東省、河北省等毛皮動物養殖大省，貉細小病毒病均有報道[2-5]，細小病毒已經成為威脅毛皮動物養殖業的主要病原之一。實驗室分離鑒定，可以更加準確的鑒定病原，從而科學的指導臨床治療。目前防控貉細小病毒常用的疫苗主要有兩種：一種是水貂腸炎滅活苗，另一種是水貂腸炎與水貂犬瘟熱的二聯疫苗。雖然水貂腸炎病毒與貉細小病毒具有很高的基因同源相似性，但在VP2 結構蛋白關鍵位點上有所不同，因此，研發有針對貉源細小病毒的疫苗非常有必要性。