KRAS 基因多態性與云南漢族人群非小細胞肺癌的相關性分析

梁 燕 ，王 磊 ，雷 鳴 ，陳本超 ，孫 萍 ，李 帥 ，劉 莉 ，王倩蓉 ，廖曼霖 ，馬千里

（1）云南開放大學健康護理學院，云南 昆明 650500;2）昆明醫科大學第三附屬醫院胸外科，云南 昆明 650118;3）昆明市兒童醫院，云南 昆明 650228）

根據最新的全球癌癥統計，2020 年約1 000萬人死于癌癥相關疾病。在中國，2020 年癌癥死亡病例約300 萬例，占全世界的30.2%[1]。在所有的癌癥中，肺癌是男性癌癥發病占比（14.3%）和癌癥死亡占比（21.5%）最高的癌癥。在女性中，肺癌是女性癌癥發病占比（8.4%）及癌癥死亡占比第一（13.7%）的癌癥[1]。肺癌的發生是一個非常復雜的過程，是多種因素共同作用的結果。除吸煙，空氣污染等被認為是肺癌發生的重要危險因素以外[2]，越來越多的研究發現，遺傳因素同樣發揮著重要作用[3]。

Kirsten 大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（kirsten rat sarcoma viral oncogenehomolog，KRAS）基因是在人類癌癥中發現的第一個致癌基因[4]，其為RAS家基因族的一員。研究認為，遺傳變異是導致癌癥發生的重要因素，而其中，由RAS 家族成員引起的突變最為常見，約27%的腫瘤發生與其密切相關[5]。Tomasini 等研究認為部分腫瘤的發生發展與KRAS 基因過表達或者突變導致的表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）通路持續活化相關[6]。

單核苷酸多態性（single nueleotide polymorphism，SNP）定義為一個核苷酸插入、缺失或改變成為其他核苷酸。基因的SNP 可影響基因正常表達或蛋白質的變異，從而影響疾病的發生發展[7]。如同其他致癌基因一樣，KRAS 基因中的SNP 也被發現與多種癌癥的發生發展具有相關性[8]。chneiderova 等發現KRAS 基因中 rs712 基因型 TT的攜帶者通過影響與微小核糖核酸（micro RNA，miRNA）的相互作用，從而導致 miRNA 表達差異而降低患直腸癌的易感性[9]。

本研究選取KRAS 基因中3′UTR 區域3 個SNP 位點（rs12587G >T、rs12245A >C、rs1137282A >G），研究其與非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）的相關性。在此基礎上，對病例組進行分層分析，進一步研究這3個SNP 位點與非小細胞肺癌病理類型以及臨床分期的相關性。以期為非小細胞肺癌的的早期診斷以及治療提供新的靶點及思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究設置病例組和對照組。病例組：455例確診為非小細胞肺癌的患者，病例確診時間：2012 年3 月至2016 年2 月期間，病例確診醫院：昆明醫科大學第三附屬醫院。病例排除要求參照實驗室前期已經建立的排除標準[10]。病例組排除術前接受放化療等抗腫瘤治療的患者；排除患有其他惡性腫瘤的患者。選取同期在同一醫院體檢的健康人群391 人作為對照組。所有參加者均為居住于云南地區彼此無血緣關系的漢族個體。研究方案經醫院倫理委員會審查批準，所有樣本采集均征得本人知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 樣品采集及基因組DNA 提取使用EDTA抗凝采血管，采集病例組和對照組空腹靜脈血5 mL。樣品基因組DNA 提取采用全血基因組DNA 提取試劑盒（QIAamp DNA Blood Mini Kit，德國QIAGEN 公司），按照說明書操作。采用超微量紫外可見分光光度計（NanoDrop-2000，美國Thermo Fisher Scientific 公司）檢測基因組DNA 的濃度和純度。基因組DNA 置于2 ℃至8 ℃儲存。

1.2.2 基因分型基因分型方法采用TaqMan 探針法。TaqMan 探針（TaqMan SNP Genotyping Assays）和SNP 分型試劑（TaqPath? ProAmp?Master Mix）購買于美國Applied Biosystems 公司。SNP 位點rs12587 分析序列號為C－12104199_10、SNP 位點 rs12245 分析序列號為C－176064436_10、SNP 位點rs1137282 分析序列號為C－25471658_10。SNP 分型檢測使用美國Applied Biosystems 公司QuantStudio 6 Flex 實時熒光定量PCR 儀，具體檢測過程及驗證方法參照實驗室已經建立的方法[11]。

1.3 統計學處理

本研究統計學分析采用SPSS（19.0）軟件進行，采用t檢驗分析各組間的年齡差異，采用卡方（χ2）檢驗分析各組間的性別差異，采用哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium）檢驗樣品的代表性。并用χ2檢驗比較各組間SNP 位點等位基因和基因型頻率的差異。采用SNPStats 軟件（https://www.snpstats.net/start.htm）對 SNP 位點基因型進行遺傳模式的分析，共分析五種遺傳模式（共顯性模式、顯性模式、隱性模式、超顯性模式和邏輯累加模式），同時計算赤池信息量準則（akaike information criterion，AIC）和貝葉斯信息準則（bayesian information criterions，BIC）的數值，并以此來確定最優的遺傳模式（具有最小AIC、BIC 數值）。采用 SHEsis（http://analysis.biox.cn/myAnalysis.php）軟件計算各Kras 基因中各SNP 位點間的連鎖不平衡關系。根據連鎖不平衡結果構建單倍型，采用χ2檢驗比較構建的單倍型在各組中分布頻率的差異。統計學分析中，當P<0.05 認為差異具有統計學意義，當存在多重比較時，采用Bofferroni 校正，當校正后P<0.016（0.05/3）時，認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象基本特征

本研究病例臨床特征分析見表1。病例組和對照組排除了性別和年齡差異（P>0.05）。病例組分為鱗癌164 例、腺癌265 例、鱗癌合并腺癌8 例，其他類型肺癌18 例。臨床分期為I 期+II期148 例、III 期+IV 期307 例。

表1 病例的臨床特征（n）Tab.1 The clinical characteristics of the subjects enrolled in this study（n）

2.2 Hardy-Weinberg 平衡檢驗研究樣本群體代表性

KRAS 基因rs12587、rs12245、rs1137282 位點基因型在對照組（P=0.130、0.846、0.485）的分布均符合Hardy-Weinberg 平衡檢驗（P>0.05），說明本研究的樣本為具有群體代表性的隨機樣本。

2.3 KRAS 基因SNP 位點與非小細胞肺癌（NSCLC）的相關性

rs12587（G >T）位點等位基因在NSCLC 組與對照組中分布頻率的差異有統計學意義（P=0.008），其中G 等位基因可能是NSCLC 發生的風險因素（OR=1.365，95%CI：1.086～1.716）。rs12587位點基因型在NSCLC 組與對照組中分布頻率的差異經Bofferroni 校正后無統計學意義（P=0.035）。rs12245、rs1137282 位點等位基因與基因型在NSCLC 組與對照組中分布頻率的差異均無統計學意義（P>0.017），見表2。

表2 KRAS 基因SNP 位點等位基因和基因型在NSCLC 和對照組的分布頻率[n（%）]Tab.2 The allelic and genotypic frequencies of SNPs in KRAS gene between NSCLC case and control groups [n（%）]

2.4 KRAS 基因SNP 位點與NSCLC 相關性的遺傳模式分析

rs12587 位點的最優遺傳模式為邏輯累加模式，該結果表明，該位點2T/T+G/T 基因型與與NSCLC 的風險降低有關（OR=0.75，95%CI：0.60～0.94）見表3。rs12245 與rs1137282 位點與NSCLC 的發生無相關性（P>0.05），見表3。

表3 KRAS 基因3 個SNP 位點與NSCLC 相關性的遺傳模式分析[n（%）]Tab.3 The inheritance analysis of three SNPs between NSCLC and control groups [n（%）]

2.5 KRAS 基因SNP 位點連鎖不平衡分析及單倍型構建

KRAS 基因3 個SNP 位點連鎖不平衡分析結果顯示，3 個SNP 位點rs12587、rs12245、rs1137282存在連鎖不平衡，D’值分別為0.993、0.932、0.938。單倍型結果顯示，單倍型rs12587Grs12245T-rs1137282A 頻率在NSCLC 組與對照組中的差異有統計學意義（P=0.041），但Bofferroni校正后則無統計學意義（P>0.05），見表4。其余單倍型頻率在NSCLC 組與對照組的差異無統計學（P>0.05）。

表4 NSCLC 組和對照組的單倍型分布差異[n（%）]Tab.4 The haplotype analysis between CC and control group [n（%）]

2.6 KRAS 基因SNP 位點與NSCLC 病理類型的相關性

根據病理類型分層分析結果顯示，鱗癌組與對照組的rs12587 位點等位基因和基因型頻率差異有統計學意義（P<0.001、P=0.001），其中等位基因G 是鱗癌的風險因素（OR=0.55，95%CI0.39～0.77），見表5。鱗癌組與對照組的rs12245位點等位基因和基因型頻率差異有統計學意義（P=0.003、P=0.001），等位基因G 是鱗癌發生的風險因素（OR=0.60，95%CI0.43～0.84），見表5。鱗癌組和對照組中rs1137282 位點等位基因及基因型頻率差異無統計學意義（P>0.05），見表5。而在腺癌和對照組中，以上3 個位點等位基因及基因型頻率均差異無統計學意義（P>0.05），見表5。

表5 KRAS 基因中SNP 位點的等位基因和基因型在鱗癌病例組、腺癌病例組和對照組的分布頻率[n（%）]Tab.5 The allelic and genotypic frequencies of SNPs in KRAS gene between SCC，AC and control groups [n（%）]

2.7 KRAS 基因SNP 位點與NSCLC 病理類型相關性的遺傳模式分析

在鱗癌組與對照組的比較分析中，rs12587 位點的最優遺傳模式為顯性模式，攜帶G/T+T/T 基因型的個體患鱗癌的風險顯著降低（P<0.001，OR=0.45，95%CI0.30～0.68），見表6。rs12245位點的最優遺傳模式為超顯性模式，攜帶A/T 基因型的個體患鱗癌的風險顯著降低（P<0.001，OR=0.43，95%CI0.28～0.67），見表6。在不同遺傳模式下，3 個SNP 位點與腺癌無相關性（P>0.05），見表6。

表6 SNP 位點在NSCLC 不同病理類型與對照組的遺傳模式分析[n（%）]Tab.6 The inheritance analysis of the SNP sites between SCC，AC group and control group [n（%）]

2.8 KRAS 基因SNP 位點與NSCLC 臨床分期的相關性

臨床分期的分層分析結果顯示，rs12587，rs12245，rs1137282 位點與NSCLC 的臨床分期無相關性（P>0.05）。

3 討論

引起癌癥發生的病因和誘因眾多，其中遺傳因素所起的作用不容忽視。KRAS 基因編碼的蛋白屬于小的GTPase 膜結合蛋白的一種，在細胞中作為控制細胞活躍和不活躍狀態的分子開關，KRAS 在其活躍狀態下可激活許多不同的細胞內傳導信號通路[5]，導致下游信號通路被過度活化，從而抑制惡性腫瘤細胞凋亡，刺激促進其生長[12?13]。

MiRNA 是一組非編碼小RNA，其和基因3′UTR 區域的SNP 位點的相關性可能進一步影響到基因的表達[8，14?15]。已有研究證明癌癥的發生與KRAS 基因3′UTR 區域的SNP 具有相關性[16]。例如，位于 KRAS 基因 3′ UTR 區域的與miRNA（let-7 miRNA）互補位點的SNP，與KRAS表達增加和let-7 miRNA 水平降低相關，并已被證明會增加非小細胞肺癌的風險[17]。

本研究發現，NSCLC 組與對照組中，KRAS基因的rs12587 位點等位基因頻率具有顯著差異，其中G 等位基因可能與NSCLC 的發生風險相關。同時，遺傳模式分析顯示，2T/T-G/T 基因型個體比G/G 基因型個體患NSCLC 的風險顯著降低。2016 年，Dai 等[18]研究表明rs12587 位點與中國人群結直腸癌無關。隨后，Lin 等[19]的研究表明rs12587 與中國兒童神經母細胞瘤不相關。但是，2019 年，Fu 等[20]的研究表明rs12587 位點GT 基因型增加了腎母細胞瘤的風險。造成研究結果差異的原因可能是，rs12587 位點在不同的腫瘤類型中發揮的作用不同，甚至是同一類型腫瘤的不同類型。如本研究就發現，rs12587 位點與NSCLC 鱗癌的發病風險相關，但與腺癌的發病風險無相關性。

本研究發現，rs12245 位點攜帶A/T 基因型的個體患鱗癌的風險顯著降低。2014 年，Cipollini等[21]發現rs12245 與女性患卵巢癌易感性風險增加有相關性。2016 年，Dai 等[18]研究KRAS 基因上包含rs12245 位點在內的6 個SNP 位點，并未發現rs12245 與中國人群結直腸癌的生存及復發轉移之間的相關性。2020 年，Liu 等[22]的研究表

明在非霍奇金淋巴瘤患者中rs12245 位點的TT 基因型增加了KRAS 基因表達量。綜合以上研究，可以發現，rs122455 與不同類型癌癥的風險相關性并不一致。而要進一步驗證rs12245 位點與鱗癌的風險相關性，則需進一步擴大人群樣本量。

本研究沒有發現rs1137282 與NSCLC 的相關性。2017 年，Sullivan 等發現NSCLC 患者中，rs1137282 位點攜帶等位基因G（A/G+G/G）的患者3 a 無復發生存率是53%，基因型為A/A 的患者3 a 無復發生存率是76%，差異有統計學意義（P=0.02）。基于以上結果，Sullivan 等[23]認為rs1137282 可被視為可切除 NSCLC 患者復發的預后因素。2018 年，Riera 等[24]發現rs1137282 的GG 基因型與 II 期結腸癌患者的總生存期下降顯著相關。2019 年，Shen 等[25]發現 KRAS 中的rs1137282 與甲狀腺乳頭狀癌患者遠處轉移性疾病的低風險相關。以上研究結果提示，rs1137282 位點可能與癌癥患者的復發、生存及轉移相關，而關于它在癌癥的發生發展中的相關性作用還需在更多疾病類型及更大人群樣本中進一步驗證。

值得注意的是，雖然本研究發現rs12587 位點與NSCLC 的發生具有相關性，但是單倍型分析結果卻顯示3 個位點構建的單倍型與NSCLC 的發生發展沒有相關性。造成這一差異的原因可能是：1，本研究的病例數相對中等，但不足以獲得有差異的統計結果，因此單倍型分析無相關性；2，KRAS 基因對于個體非常重要，影響KRAS 基因3′UTR 穩定性的位點可能不止1 個位點，當rs12587 位點發生變異，KRAS 基因可通過其他位點抵消rs12587 位點變異對KRAS 基因的影響。

今后要充分研究KRAS 基因與非小細胞肺癌的相關性，在擴大樣本量的同時，尚需結合更多SNP 位點進行系統性分析，同時輔以功能驗證。