不同時期NICS 檢測在平衡易位患者PGT 治療中的臨床應(yīng)用

李明穎 ，李敏瑤 ，晏家驄 ，田 美 ，李永剛

（1）云南省第一人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，云南 昆明 650032;2）云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650500）

平衡易位（reciprocal translocation）是常見的一種染色體結(jié)構(gòu)異常，在新生兒中，平衡易位攜帶者發(fā)生率約為0.2%[1]。平衡易位通常發(fā)生在非同源染色體片段交換時，若易位沒有造成遺傳物質(zhì)的獲得或者丟失，且易位的斷點沒有導(dǎo)致基因的截斷，則攜帶患者表型正常。然而研究表明，平衡易位攜帶患者不孕及反復(fù)流產(chǎn)（recurrent pregnancy loss，RPL）的風(fēng)險顯著增加。據(jù)報道，RPL 患者的染色體異常以染色體結(jié)構(gòu)異常為主，其中以平衡易位的檢出最多。在有反復(fù)流產(chǎn)史的夫婦中，一方為平衡易位攜帶者的比例約為2.5%～3.2%[2]。另外，當(dāng)染色體易位的斷裂點與生殖的基因有關(guān)時，患者還會表現(xiàn)為不孕不育。

平衡易位配子經(jīng)過減數(shù)分裂，理論上可形成18 種配子。同正常配子結(jié)合后，形成的合子包括一種完全正常，一種易位攜帶，其余均為遺傳物質(zhì)不平衡。因而，理論上，若夫妻雙方一方為平衡易位攜帶者，其獲得遺傳物質(zhì)平衡胚胎的比例僅為2/18[3]。如果不進行干預(yù)，平衡易位攜帶者的妊娠結(jié)局主要有自然流產(chǎn)、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、生育缺陷兒等[3?4]，其中，自然流產(chǎn)率可達50%-80%；常見胎兒異常有心臟發(fā)育異常、神經(jīng)發(fā)育遲滯、先天愚型等等；性染色體相關(guān)的平衡易位會導(dǎo)致不孕的風(fēng)險，這些都給患者夫婦家庭造成嚴(yán)重的經(jīng)濟和精神壓力。

隨著人類輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）的發(fā)展，ART 技術(shù)已經(jīng)不僅僅用于不孕患者的治療，而是更多的參與到優(yōu)生優(yōu)育的干預(yù)中來。在ART 治療周期中，非整倍體是導(dǎo)致種植失敗和流產(chǎn)的重要原因之一。因此，建立一套有效的鑒別整倍體胚胎的方法，對于改善ART 周期臨床結(jié)局非常關(guān)鍵[5]。近年來，隨著植入前遺傳學(xué)檢測（preimplantation genetic testing，PGT）的出現(xiàn)及推廣，通過檢測胚胎染色體，有效的減少了染色體異常胚胎移植的比例，進而降低了平衡易位攜帶者自然流產(chǎn)以及不良孕產(chǎn)的發(fā)生比例。針對平衡易位患者，可以進行PGTSR（Structural rearrangements）的治療，通過對染色體拷貝數(shù)變異（copy number variants，CNVs）進行檢測，選擇遺傳物質(zhì)平衡的胚胎移植[6]。PGT 的檢測樣本主要來源于囊胚滋養(yǎng)外胚層（trophectoderm，TE）細胞的活檢，二代測序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）經(jīng)過有效性的驗證，已廣泛應(yīng)用于臨床PGT 的檢測。然而，盡管囊胚活檢技術(shù)是目前進行PGT 的主流方法，但是對于胚胎來說仍是一項有創(chuàng)的操作，對于活產(chǎn)胎兒及其后期發(fā)育的影響尚不明確；另外，囊胚活檢操作的技術(shù)難度大，所需設(shè)備昂貴，這也限制了該項技術(shù)在生殖中心的普遍應(yīng)用。因此，建立一種無創(chuàng)的、快速簡易的、成本更低的評估胚胎染色體的方法，將成為ART 領(lǐng)域的重大突破。

無創(chuàng)胚胎染色體篩查（non-invasive chromosome screening，NICS）是指通過結(jié)合NGS 技術(shù)，檢測培養(yǎng)至囊胚期時培養(yǎng)液中游離的DNA（cell-free DNA，cfDNA），以cfDNA 的檢測結(jié)果來反映整個胚胎的染色體情況，在不進行活檢的前提下，得到胚胎染色體的篩查結(jié)果，作為甄選移植胚胎的參考條件。有研究表明，NICS 技術(shù)在染色體篩查方面可以達到0.882 的敏感度和0.840 的特異度[7]，然而由于該項技術(shù)創(chuàng)立及應(yīng)用時間還較短，其有效性還有待驗證。隨著技術(shù)的不斷改進提升，該技術(shù)的精度和深度也可不斷提高。

本研究以傳統(tǒng)囊胚TE 細胞活檢/未形成囊胚的廢棄整胚的染色體測序結(jié)果為對照，利用NICS 技術(shù)對胚胎的不同階段培養(yǎng)液進行測序檢測，探討不同時期培養(yǎng)液NICS 檢測技術(shù)在平衡易位患者治療中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究以2018 年3 月至2020 年7 月在云南省第一人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科進行PGT 治療的10位平衡易位攜帶患者為研究對象，共收集186 條測序數(shù)據(jù)。根據(jù)檢測樣本，將所有數(shù)據(jù)分成3 組，包括D3 培養(yǎng)液測序結(jié)果（D3 NICS）39 條，D5 培養(yǎng)液測序結(jié)果（D5 NICS）72 條，胚胎/TE 測序結(jié)果75 條；其中，同時有D3 NICS 和胚胎/TE 測序結(jié)果的胚胎36 個，同時有D5 NICS 和胚胎/TE 測序結(jié)果的胚胎69 個，3 種測序結(jié)果都有的胚胎30 個。

本研究已獲得云南省第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有參與患者均已簽署相關(guān)知情同意書。

1.2 研究方法

胚胎采用微滴法培養(yǎng)，D3 胚胎轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)液后，回收D3 培養(yǎng)液，放入含有5 μL 細胞裂解液的PCR 管中并做好標(biāo)記；囊胚活檢后，回收對應(yīng)活檢胚胎的囊胚培養(yǎng)液，放入含有5 μL 細胞裂解液的PCR 管中并做好標(biāo)記；囊胚培養(yǎng)結(jié)束后，收集未形成囊胚的整胚及對應(yīng)培養(yǎng)液，放入含有5 μL 細胞裂解液的PCR 管中并做好標(biāo)記，以上樣本由第三方冷鏈運輸公司運至生物公司進行培養(yǎng)液濃度測定和染色體非整倍體分析。

對測序結(jié)果進行2 個變量的分析，分別為檢測結(jié)果和CNVs 結(jié)果。其中，檢測結(jié)果根據(jù)是否檢測成功分為檢測失敗（N/A）和檢測成功（非N/A）；對檢測成功（非N/A）的數(shù)據(jù)進行CNVs 結(jié)果的分析，根據(jù)測序結(jié)果分為異常（染色體CNVs 非平衡）、正常（染色體CNVs 完全正常/平衡易位攜帶）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

本研究采用SPSS 20.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，其中計數(shù)資料用例數(shù)和百分?jǐn)?shù)[n（%）] 表示，各組結(jié)果的差異分析用χ2檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各類型樣本檢測結(jié)果分布

在3 組檢測結(jié)果中，D3 NICS 的檢測失敗率最高，達到38.46%；在胚胎/TE 組中，僅有2 例樣本檢測失敗，均為活檢（TE）樣本，可能與活檢樣本取樣數(shù)量少和操作損傷有關(guān)。在染色體CNVs 結(jié)果上，D3 NICS 檢出的異常率最低，僅為25.64%，這同D3 培養(yǎng)液中DNA 數(shù)量較少有關(guān)。從整體結(jié)果分布來看，3 組的檢測結(jié)果和CNVs結(jié)果之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001/P<0.01），且D3 NICS（a）同胚胎/TE 組的檢測結(jié)果和CNVs結(jié)果的差異都有統(tǒng)計學(xué)意義，D5 NICS 同胚胎/TE組的檢測結(jié)果和CNVs 結(jié)果的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，同時D3 NICS 同D5 NICS 的檢測結(jié)果和CNVs 結(jié)果的差異也有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

表1 各組樣本CNV 檢出結(jié)果匯總[n（%）]Tab.1 Summary of CNV results in different groups [n（%）]

2.2 相同胚胎培養(yǎng)液同胚胎結(jié)果比較

2.2.1 相同胚胎的D5 培養(yǎng)液同胚胎/TE 結(jié)果比較在測序結(jié)果中，同時含有D5 NICS 和胚胎/TE 檢測結(jié)果的胚胎有69 個，共有138 條檢測數(shù)據(jù)。2 組的檢測結(jié)果之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.085），D5 NICS 組檢測失敗率（N/A%）略高于胚胎/TE 組（10.14%/2.90%），2 組的CNVs 結(jié)果分布之間的差異也無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.944），見表2。

表2 相同胚胎D5 NICS 和胚胎/TE 測序結(jié)果比較[n（%）]Tab.2 Comparison of sequencing results between D5 NICS group and embryo/TE from the same embryo [n（%）]

2.2.2 相同胚胎的D3 培養(yǎng)液同胚胎/TE 結(jié)果比較在測序結(jié)果中，同時含有D3 NICS 和胚胎/TE 檢測結(jié)果的胚胎有36 個，共有72 條檢測數(shù)據(jù)。2 組檢測結(jié)果之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001），D3 NICS 組的檢測失敗率（N/A%）高于胚胎/TE 組（41.67%/2.78%），2 組之間CNVs 結(jié)果的分布差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見表3。

表3 相同胚胎D3 NICS 和胚胎/TE 測序結(jié)果比較[n（%）]Tab.3 Comparison of sequencing results between D3 NICS group and embryo/TE from the same embryo [n（%）]

2.2.3 相同胚胎的3 組數(shù)據(jù)結(jié)果比較在測序結(jié)果中，同時含有D3 NICS、D5 NICS 和胚胎/TE 檢測結(jié)果的胚胎有30 個，共有90 條檢測數(shù)據(jù)。3組檢測結(jié)果和CNVs 結(jié)果之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01/P<0.01），且D3 NICS 組和胚胎/TE 組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，D5 NICS 組和胚胎/TE 組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。分別重新對D3 NICS 和胚胎/TE，以及D5 NICS 和胚胎/TE 檢測結(jié)果和CNVs 結(jié)果進行兩組間χ2檢驗，結(jié)果表明，在檢測結(jié)果和CNVs 結(jié)果兩個變量上，D3 NICS 和胚胎/TE 之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01/P<0.05），D5 NICS 和胚胎/TE 染色體CNVs結(jié)果之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.085/P=0.658），見表4。

表4 不同階段 NICS 同胚胎/TE 測序結(jié)果比較[n（%）]Tab.4 Comparison of sequencing results in NICS groups of different stages and embryo/TE group [n（%）]

3 討論

目前，平衡易位患者可以通過PGT 檢測，移植遺傳物質(zhì)平衡的胚胎，從而減少早期流產(chǎn)的發(fā)生。由于PGT 治療過程中的胚胎活檢操作為有創(chuàng)性操作，有些研究認(rèn)為該操作會降低胚胎質(zhì)量，引起種植失敗[8?9]；在動物模型的研究表明，活檢胚胎操作可能引起表觀遺傳改變和神經(jīng)退行性組織、腎腺的紊亂，以及卵巢功能缺陷等[10]。因而，尋找一種可替代的無創(chuàng)檢測方法是PGT 治療的主要的發(fā)展方向之一。2020 年，Rubio 等[11]發(fā)表了一項多中心前瞻性研究結(jié)果表明，胚胎cfDNA 分析得到的CNVs 與相應(yīng)TE DNA 的染色體分析一致率為78.2%（866/1108）。2021 年，Chen等人研究結(jié)果提示，活檢細胞檢測和NICS 檢測與整胚檢測一致性之間的差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義[12]。

目前，對于NICS 的研究多取材于D5 培養(yǎng)液，本研究中，筆者將D3 培養(yǎng)液同樣納入研究范疇，在獲得的186 條測序數(shù)據(jù)中，包括D3 NICS 結(jié)果39 個，D5 NICS 結(jié)果72 個，胚胎/TE 測序結(jié)果75 個。從整體結(jié)果來看，3 組數(shù)據(jù)的檢測失敗率（N/A%）和CNVs 結(jié)果分布的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001/P<0.01），這種差異主要來自于D3 NICS 組和胚胎/TE 組之間的差異，D5 NICS 組和胚胎/TE 組之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

為了評估D3 NICS 和D5 NICS 的用于臨床診斷的準(zhǔn)確性，筆者以同一胚胎的胚胎/TE 的CNVs 結(jié)果作為對照進行分析。結(jié)果表明，D5 NICS 的CNVs 結(jié)果分布同胚胎/TE 結(jié)果相比，二者之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.994）；但是，D3 NICS 的CNVs 結(jié)果分布同胚胎/TE 結(jié)果相比，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。有研究表明，相對于D3 培養(yǎng)液，D5 培養(yǎng)液對一些特定基因的檢測更為可靠[13]，筆者的結(jié)果也從CNVs 的角度驗證了D5 NICS 診斷的可靠性。D5 NICS 的檢測結(jié)果同胚胎/TE 檢測結(jié)果更接近，具有替代活檢操作進行胚胎染色體CNVs 診斷的應(yīng)用潛能，但D3 NICS 的檢測結(jié)果準(zhǔn)確性較低，無法用于臨床診斷。

在檢出率方面，Luca Galluzz 等[13]在2015 年的研究中表明，D3 胚胎培養(yǎng)液和D5 胚胎培養(yǎng)液中g(shù)DNA 檢出率分別為93.7% 和94.4%，gDNA含量僅分別為（80±70）pg 和（99±113）pg，但二者之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。由于培養(yǎng)液中cfDNA 含量較少，在現(xiàn)有測序深度和技術(shù)的前提下，檢測失敗率要高于活檢樣本。在筆者的研究結(jié)果中，D5 NICS 檢測失敗率略高于胚胎/TE 組（10.14%/2.90%），但2 組之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.085）；D3 NICS 的檢測失敗率高于胚胎/TE，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（41.67%/2.78%，P<0.001）。有研究表明，隨著培養(yǎng)時間的延長，DNA 降解比例會更高[10]。在筆者的研究中，D3培養(yǎng)液收集時間大約在72 h，D5 培養(yǎng)液收集時間約為48～72 h，D3 培養(yǎng)液中更多的DNA 降解比例也可能會影響最終結(jié)果的檢出率和準(zhǔn)確性。

目前，cfDNA 分泌的機制尚不明確，大部分的觀點認(rèn)為cfDNA 主要來源于胚胎發(fā)育過程中產(chǎn)生的凋亡細胞。有跟蹤研究表明，凋亡胚胎的來源主要是后續(xù)發(fā)育成胎兒的內(nèi)細胞團（inner cell mass，ICM）[14]。另外，活檢采集的TE 細胞數(shù)目有限，無法反映整個胚胎的染色體情況，可能會造成錯誤的遺傳診斷。對于ICM 和TE 的研究表明，二者染色體的一致率在62.1%～86.2%不等[14?17]。因而相對于TE 活檢，培養(yǎng)液中的cfDNA 更能反映ICM 的染色體情況。Shitara 等[18]在2021 年的研究發(fā)現(xiàn)，以培養(yǎng)到第10 天的胚胎為對照，相對于TE 活檢結(jié)果，培養(yǎng)液檢測的結(jié)果更為可靠。

筆者的研究表明，從檢測失敗率和CNVs 結(jié)果分布來看，D5 NICS 同胚胎/TE 之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義；相對于D3 NICS，D5 NICS 在平衡易位患者胚胎的診斷上更有優(yōu)勢，具有替代活檢操作進行PGT 診斷的潛能。在臨床應(yīng)用上，母源DNA 污染和培養(yǎng)液中較低的cfDNA 含量是限制NICS 臨床應(yīng)用的最大因素。NICS 檢測技術(shù)準(zhǔn)確度的提高，依賴于受精方法、培養(yǎng)方法和樣本處理方法的優(yōu)化和測序技術(shù)的進步。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，測序深度和精度在不斷提高，NICS 技術(shù)作為無創(chuàng)的染色體診斷技術(shù)，在平衡易位患者的治療中，將有著更為普遍的應(yīng)用前景。