白芍總苷對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡模型大鼠Trap1基因多態(tài)性與維生素D代謝的影響*

黃美瓊，邢飴喜，梁 金，陳維飛，劉 贊

（海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院風(fēng)濕科，海南 海口 570311）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）為多發(fā)于女性的免疫功能異常性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未明晰[1］。目前臨床多采用糖皮質(zhì)激素+免疫抑制劑治療，但長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致免疫力低下、向心性肥胖，甚至精神異常[2］。白芍總苷對(duì)自身免疫缺陷疾病有一定防治作用，其具有抑制活性氧自由基形成及清除多余自由基的作用，可通過發(fā)揮抗凋亡、抗氧化及抗炎等作用保護(hù)機(jī)體器官[3］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，從中藥白芍根部提取的白芍總苷，具有調(diào)節(jié)機(jī)體神經(jīng)及免疫的作用[4］，SLE患者使用后預(yù)后較好[5］。腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白1（TRAP1）為線粒體伴侶蛋白，其基因位于16號(hào)染色體（16p13.3區(qū)域），是熱休克蛋白90（HSP90）家族的新成員。TRAP1可通過折疊、重折疊受損蛋白等機(jī)制保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激等損傷，被認(rèn)為是細(xì)胞氧化應(yīng)激系統(tǒng)的關(guān)鍵成分。染色體16p13區(qū)域內(nèi)存在和自身免疫性疾病發(fā)病有關(guān)的基因，如KIAA0350和MEFV基因[6］。TRAP1基因的過表達(dá)也被認(rèn)為與多藥耐藥性有關(guān)[7］。研究表明，TRAP1在乳腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中表達(dá)上調(diào)，但對(duì)其在免疫性疾病中的作用并無報(bào)道[8］。維生素D缺乏被認(rèn)為是SLE的病因[9］，但尚無白芍總苷與其相關(guān)性的報(bào)道。本研究旨在探討白芍總苷可否通過調(diào)控核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路對(duì)SLE大鼠Trap1基因多態(tài)性與維生素D代謝產(chǎn)生影響，進(jìn)而研究其對(duì)SLE的療效。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：Thermo Histocentre3型全自動(dòng)組織包埋機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；HH34000000全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（上海瑋馳儀器有限公司）；Leica-RM2135型高級(jí)組織切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；ABI7500定量PCR儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）；Cabas E601型全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（德國(guó)Roche公司）。

試藥：白芍藥材（亳州市滬譙藥業(yè)有限公司，批號(hào)17052594）；25（OH）D、1，25（OH）2D3試劑盒（深圳海思安生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為20210196，20211021）；兔抗大鼠一抗NF-κB及辣根過氧化物酶標(biāo)記（HRP）的山羊抗兔二抗（英國(guó)Abcam公司，批號(hào)分別為20210289，20211062）；mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）試劑盒（寶生物工程有限公司，批號(hào)分別為20210345，20210632）；RIPA裂解液（北京索萊寶生物技術(shù)公司，批號(hào)為SL059234）。

動(dòng)物：SD大鼠50只，健康，雄性，體質(zhì)量180～200 g，6～8周齡。由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（皖）2017-001，該實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)202005010）。所有大鼠均置溫度21～23℃、相對(duì)濕度40%～70%的實(shí)驗(yàn)條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 方法

1.2.1 白芍總苷制備

將白芍藥材與親水性溶液攪拌，50～90℃提取3次，合并濾液、濾過，將其通過減壓回收制成干燥的粗提取物；采用親水性溶液溶解，過濾成水溶液；采用大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附、純化；再次洗脫減壓，制成白芍總苷提取物。

1.2.2 建模與分組

將50只SD大鼠隨機(jī)分為空白組（等體積生理鹽水）、模型組（等體積生理鹽水）及白芍總苷低、中、高劑量組（0.5，1，5 g/mL），各10只。空白組大鼠單次腹腔注射生理鹽水每10 g體質(zhì)量0.2 mL，其余各組大鼠均注射降植烷，每只0.5 mL，每周1次，連續(xù)3周。以大鼠尿蛋白質(zhì)量濃度介于0.1～1.0 g/L為模型復(fù)制成功。建模成功后，白芍總苷各劑量組分別灌胃給予相應(yīng)劑量白芍總苷，每日1次，連續(xù)28周。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)

尿蛋白水平：初始給藥后每月1次提尾刺激大鼠排尿，收集尿液，浸濕Albustix檢測(cè)試紙反應(yīng)區(qū)，觀察試紙顏色與色板比較，根據(jù)顯色度分為-，±，+，++，+++，++++。

腎臟組織病理形態(tài)：給藥結(jié)束后，頸椎脫臼處死大鼠，解剖觀察腎臟有無肉眼可見病變，病變組織制成石蠟切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察組織病變。

血清學(xué)指標(biāo)及蛋白表達(dá)水平：大鼠麻醉后從眼底靜脈叢取血，肝素抗凝，3 000 r/min離心10 min，分離得血清，采用電化學(xué)發(fā)光免疫法測(cè)定25（OH）D及1，25（OH）2D3水平，嚴(yán)格按試劑盒說明書要求操作；提取血清總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書要求，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)NF-κB的mRNA相對(duì)表達(dá)量：ΔCt=目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct，引物序列見表1；采用Western blot法檢測(cè)大鼠NF-κB蛋白表達(dá)水平。提取血清總蛋白，測(cè)定濃度，然后上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜后，以牛血清白蛋白（BSA）封閉2 h，洗膜，孵育過夜，再加入一抗、二抗孵育，再次洗膜，顯色，5min后凝膠成像，采集圖片。

1.2.4Trap1基因型檢測(cè)

引物序列見表1，PCR反應(yīng)總體積25μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，60℃或62℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，進(jìn)行單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）分析，取PCR產(chǎn)物與Loading buffer混勻，變性后再次電泳、顯色。根據(jù)NCBI網(wǎng)站已知的大鼠單核苷酸多態(tài)性（SNP）基因庫(kù)可確定突變位點(diǎn)，此處將G/G定義為AA基因型，G/A定義為AB基因型，A/A定位為BB基因型。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較行方差分析；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，行χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 尿蛋白水平

與模型組比較，白芍總苷中、高劑量組大鼠尿蛋白陽(yáng)性例數(shù)較少，且隨著劑量的增加而減少（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠尿蛋白水平比較（例，n=10）Tab.2 Comparison of urinary protein levels of rats in each group（case，n=10）

2.2 腎臟組織病理形態(tài)

與空白組比較，模型組大鼠腎臟出現(xiàn)毛細(xì)血管增生，腎小球腫大，血管周圍有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組比較，白芍總苷低、中、高劑量組腎纖維化與炎性程度減少，且中、高劑量組改善更明顯，詳見圖1。

圖1 大鼠腎臟組織病理形態(tài)（HE，×40）A.Blank group B.Model group C.TGP low-dose group D.TGP medium-dose group E.TGP high-dose groupFig.1 Histopathological morphology of rats′kidney（HE，×40）

2.3 血清學(xué)指標(biāo)

與模型組比較，白芍總苷低、中、高劑量組25（OH）D、1，25（OH）2D3水平均明顯升高，NF-κB mRNA及其蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05）。詳見表3及圖2。

表3 各組大鼠血清學(xué)指標(biāo)比較（±s，n=10）Tab.3 Comparison of serological indexes of rats in each group（±s，n=10）

表3 各組大鼠血清學(xué)指標(biāo)比較（±s，n=10）Tab.3 Comparison of serological indexes of rats in each group（±s，n=10）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。Note：Compared with those in the blank group，*P＜0.05；Compared with those in the model group，#P＜0.05.

組別空白組模型組白芍總苷低劑量組白芍總苷中劑量組白芍總苷高劑量組F值P值25（OH）D（ng/mL）40.23±8.24 13.08±5.69*19.36±2.28#27.37±2.41#35.18±2.17#53.252＜0.001 1，25（OH）2D3（pmol/L）92.18±11.39 42.36±8.74*55.29±6.14#61.47±5.08#79.24±4.36#67.313＜0.001 NF-κB 0.78±0.08 1.79±0.09*1.61±0.05#1.42±0.06#1.25±0.04#346.203＜0.001 NF-κBmRNA 0.81±0.05 1.82±0.04*1.64±0.09#1.45±0.07#1.26±0.03#427.591＜0.001

圖2 大鼠NF-κB蛋白表達(dá)Fig.2 Expression levels of NF-κB protein in rats

2.4 Trap1基因型分布

各組大鼠中AA，AB，BB基因型分布情況基本一致，且AB，BB型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表4。

表4 各組大鼠基因型分布情況[例（%），n=10］Tab.4 Distribution of rats′genotypes in each group[case（%），n=10］

3 討論

SLE屬自身免疫性疾病，突出表現(xiàn)為皮膚黏膜、骨骼肌肉、腎及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多個(gè)器官和系統(tǒng)出現(xiàn)免疫性炎癥[6］。有關(guān)該病的發(fā)病機(jī)制與治療方法是目前的研究熱點(diǎn)，糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑長(zhǎng)期或大量使用，易引發(fā)或加重感染及潰瘍性疾病，并增加高血壓、動(dòng)脈硬化等并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[9-10］。作為潛在的環(huán)境因素，機(jī)體的維生素D水平對(duì)機(jī)體免疫力影響極大。而維生素D在SLE患者體內(nèi)的作用機(jī)制可能是由可旁分泌的樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生了1，25（OH）2D3，進(jìn)而影響血清中的細(xì)胞因子聚集來減少SLE患者的免疫[11-12］。TRAP1是參與癌細(xì)胞中能量代謝調(diào)節(jié)的分子伴侶，可調(diào)節(jié)癌細(xì)胞代謝，對(duì)癌基因和腫瘤抑制因子具有雙重作用[13］。還有研究指出，NF-κB通路在免疫物質(zhì)發(fā)生特異性免疫效應(yīng)過程中起重要作用，同樣也參與調(diào)節(jié)特異性抗原產(chǎn)生特異性的細(xì)胞免疫或體液免疫過程，指出NF-κB與炎癥免疫反應(yīng)有關(guān)[14］。并且白芍總苷可調(diào)控NF-κB信號(hào)通路，對(duì)炎性疾病具有一定的治療作用。但其機(jī)制還不夠明確，且對(duì)于SLE的療效也無具體研究驗(yàn)證。

本研究結(jié)果顯示，白芍總苷灌胃后，尿蛋白呈陽(yáng)性的大鼠例數(shù)減少，這說明，其對(duì)SLE大鼠有一定的療效。腎臟組織病理結(jié)果進(jìn)一步明確，白芍總苷對(duì)SLE有較好的療效，有利于改善器官病變。活性維生素D能抑制淋巴細(xì)胞的異常增殖活動(dòng)，影響淋巴細(xì)胞的分化程度，從而影響機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)[15］。1，25（OH）2D3可通過抑制機(jī)體內(nèi)白細(xì)胞介素的產(chǎn)生和炎性細(xì)胞的活性來有效阻止機(jī)體樹突狀細(xì)胞的分化，如分泌不足就會(huì)導(dǎo)致血清維生素D代謝不足，與SLE發(fā)生發(fā)展有密不可分的關(guān)系[16］。本研究結(jié)果顯示，白芍總苷各劑量組25（OH）D、1，25（OH）2D3水平較模型組升高，說明其能影響維生素D的代謝，可提升維生素D水平，從而緩解病情。王醫(yī)林等[17］發(fā)現(xiàn)，SLE患者外周血中25（OH）D水平與免疫系統(tǒng)內(nèi)功能最重要的細(xì)胞群相關(guān)，其可能是通過調(diào)節(jié)這一細(xì)胞群來治療SLE，這與本研究結(jié)果有一定的相通之處。

檢測(cè)不同組大鼠中Trap1基因型的分布情況發(fā)現(xiàn)，其整體分布并無波動(dòng)，因此認(rèn)為，白芍總苷對(duì)大鼠模型的Trap1基因多態(tài)性影響不明顯。NF-κB在大量研究中被證實(shí)與SLE的發(fā)生相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，白芍總苷各劑量組NF-κB蛋白及mRMA表達(dá)水平較低，提示其可調(diào)控NF-κB信號(hào)通路。潘冠和等[18］研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB功能異常可顯著影響SLE的發(fā)生，還指出，其活化異常可能與皮損、狼瘡腎炎有關(guān)，并提及NF-κB參與調(diào)節(jié)輔助性T細(xì)胞17（Th17）的分化，而Th17細(xì)胞在SLE疾病的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮著一定作用，進(jìn)一步佐證了本研究結(jié)果。

綜上所述，白芍總苷對(duì)模型大鼠SLE有一定療效，機(jī)制可能為通過抑制NF-κB通路的活化改善大鼠體內(nèi)維生素D代謝不足，這對(duì)SLE的臨床治療有一定的參考價(jià)值。