“普薯32號”中LCYb基因的克隆與序列分析

唐銳敏　石源睿　徐子舟　賈小云

“普薯32號”中基因的克隆與序列分析

唐銳敏石源睿徐子舟賈小云

（山西農業(yè)大學生命科學學院山西晉中030801）

作為我國的一種重要糧食作物，甘薯在抵抗饑荒、保障糧食安全方面發(fā)揮著重要作用。近年來，對甘薯的營養(yǎng)和保健功效的研究越來越多，許多以甘薯為原料的新型食品被開發(fā)出來。β-胡蘿卜素是甘薯中一種重要的生物活性物質，能夠轉化為維生素A，維持人類眼睛和皮膚的健康，從而改善夜盲癥、皮膚粗糙的狀況。番茄紅素β-環(huán)化酶（LCYb）是參與β-胡蘿卜素合成的關鍵酶。本研究從橘肉甘薯品種“普薯32號”中分離得到基因，并對其進行序列分析和編碼蛋白的理化性質分析等。結果表明：基因的開放閱讀框長度為1 506 bp，編碼501個氨基酸。該基因編碼蛋白的相對分子質量為56.45 kDa，理論等電點為8.02，屬于親水性非跨膜蛋白。系統進化分析結果表明：甘薯LCYb與三裂葉薯LCYb的親緣關系最近。這些結果為進一步研究甘薯LCYb的功能以及調控β-胡蘿卜素合成的機制提供理論基礎。

甘薯；基因；基因克隆；β-胡蘿卜素；序列分析

甘薯（(L.)Lam.）是世界主要的糧食作物之一，其在亞洲的種植面積居世界首位，非洲次之[1]。根據成熟期薯肉顏色的不同，可將其分為白心甘薯、黃心甘薯、橙心甘薯和紫心甘薯等[2]。彩色甘薯塊根因富含類胡蘿卜素和花青素等次生代謝物，具有預防心血管疾病、抗腫瘤、調節(jié)免疫活性等功效，對人類健康具有巨大的潛在價值，因此成為開發(fā)功能食品的理想資源[3]。

類胡蘿卜素是一類重要天然色素的總稱，普遍存在于動物、高等植物、真菌、藻類和細菌中[4-5]。β-胡蘿卜素作為類胡蘿卜素家族中的重要一員，在植物體內具有多種生物學功能[6-8]。例如，β-胡蘿卜素可作為光合色素參與光合作用；能夠防止植物因光氧化而受到損害[9-10]；能使花瓣和果實顏色鮮艷，從而吸引昆蟲等動物授粉、傳播種子[11]；還參與植物響應非生物脅迫的途徑[12-13]。對人類而言，β-胡蘿卜素在抗氧化、解毒、預防心血管疾病、保護肝臟等方面具有重要的生理作用[14]。同時，β-胡蘿卜素也是維生素A的前體，可以預防夜盲癥和視力喪失，有助于維持免疫系統的正常功能[15]。

在植物體內，β-胡蘿卜素的合成過程中需要多種關鍵酶的參與。異戊烯焦磷酸（IPP）和二甲基丙烯基二磷酸（DMAPP）經過一系列的氧化還原反應合成β-胡蘿卜素[16]，其中番茄紅素環(huán)化酶（LCY）調控紅色的番茄紅素轉變?yōu)槌壬摩?胡蘿卜素。研究表明，番茄紅素與β-胡蘿卜素在植物體內所占比例的不同導致植物體所呈現的顏色有所不同，當植物體內番茄紅素積累較多，果實大多呈現紅色，而當β-胡蘿卜素較多時則呈現出橙色[17]。已報道的基因分為和，前者的作用是控制番茄紅素轉化為β-胡蘿卜素，后者則是控制番茄紅素向α-胡蘿卜素轉化[18-19]。張亞卿的研究表明，在紅肉蜜柚果實發(fā)育至成熟的整個過程中，和基因的表達量迅速降低，抑制番茄紅素轉化為類胡蘿卜素，使得紅肉蜜柚汁胞積累大量的番茄紅素，果實呈現紅色[20]。在煙草中過表達基因會影響煙草的類胡蘿卜素組分比例，同時對烤后煙葉的香氣物質含量也有所影響[21]。

本研究從橙心甘薯“普薯32號”中克隆得到，利用生物信息學技術對其及其編碼的蛋白質序列進行分析。研究結果為分析IbLCYb在β-胡蘿卜素合成途徑中的調控作用提供一定的參考，為后續(xù)甘薯品種的創(chuàng)新及品質的提高奠定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料、菌株及載體

試驗所選甘薯品種為“普薯32號”（Pushu-32），由江蘇省農業(yè)科學院徐州甘薯研究中心提供，于山西農業(yè)大學生命科學學院甘薯試驗基地種植。轉化所用菌株為大腸桿菌DH5α，由山西農業(yè)大學生命科學學院分子生物學實驗室保存。克隆載體為PMD19-T Vector。

試驗所用Prime Scrip TM RT reagent Kit反轉錄試劑盒、Marker DL系列，購自TaKara公司；PCR純化回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒購于Axy Prep公司；RNA提取試劑盒購于北京華越洋公司；PCR Mix聚合物購自邁維生物。

1.2 RNA的提取和cDNA的合成

取種植90 d的甘薯塊根0.1 g，用液氮快速冷凍并進行研磨。每個樣品做3個生物學重復。使用RNA提取試劑盒對甘薯塊根的總RNA進行提取，后使用瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA的完整性和質量，并根據TaKara反轉錄試劑盒說明書對所提RNA進行反轉錄。

1.3 IbLCYb基因克隆

根據NCBI官網上查到的甘薯基因預測序列克隆引物，F為ATGGATACTTTGCTAAAG，為TTAATCTATATCCTGTAAC。以反轉錄得到的甘薯cDNA為模板，對基因進行克隆。反應程序：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，43.6 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)，72 ℃終延伸2 min。擴增產物通過凝膠回收試劑盒（Axygen Scientific Inc., Union city, USA）將目的片段回收，并與PMD19-T相連，獲得重組質粒PMD19-T-。將重組質粒轉入大腸桿菌DH5α，并將其涂布于含有氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基上進行過夜培養(yǎng)15 h～17 h。挑取單克隆進行菌落PCR，將陽性克隆所提取的質粒送至上海生工生物公司進行測序，陽性克隆的菌液和所提質粒凍于-80 ℃保存。

1.4 甘薯IbLCYb基因的生物信息學分析

生物信息學分析軟件如表1所示，對編碼蛋白的親疏水性、理化性質、跨膜結構、信號肽、二級結構、三級結構進行預測分析。利用甘薯編碼的蛋白序列，通過BLASTp在NCBI數據庫中搜索其他植物的蛋白序列，使用MEGA7.0軟件，構建Neiber-Joing（NJ）系統發(fā)育樹，Bootstrap分析重復數為1 000。

表1　生物信息學所用分析軟件

2 結果與分析

2.1 橘肉甘薯“普薯32號”塊根RNA的提取及IbLCYb基因克隆

利用RNA提取試劑盒提取“普薯32號”塊根的總RNA，其瓊脂糖凝膠電泳結果呈現出3條帶，分別是5s、18s和28s（見圖1A）。

以F/R為克隆引物，“普薯32號”的cDNA為模板對甘薯進行基因克隆。經瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到了一條長度為1 506 bp的特異性條帶，為（見圖1B）。將目的片段割膠回收，連接PMD19-T載體，轉化大腸桿菌后進行菌落PCR，目的片段大小與cDNA長度相一致。對含有目的片段的陽性克隆進行擴繁，提取陽性克隆的質粒寄送至生物公司進行測序，測序結果與NCBI網站上甘薯預測序列相比，相似度達99.67%（見圖2），說明通過試驗所得到的結果的確是甘薯基因的序列。

圖1　“普薯32號”塊根RNA瓊脂糖凝膠電泳（A）及IbLCYb的擴增產物條帶（B）

圖2　IbLCYb測序結果與NCBI網站預測序列比對

2.2 甘薯IbLCYb蛋白的理化性質分析

對IbLCYb蛋白的理化性質進行分析，結果顯示基因編碼501個氨基酸（見圖3A），IbLCYb蛋白的相對分子質量為56.45 kDa，理論等電點為8.02。用ProtScale和TMHMM Server v. 2.0工具在線分析該蛋白序列，可判斷IbLCYb蛋白是一個無跨膜結構域的親水不穩(wěn)定蛋白（見圖3B和圖3C）。

圖3　IbLCYb蛋白的氨基酸序列（A）、疏水性分析（B）及跨膜域分析（C）

2.3 甘薯IbLCYb蛋白結構分析

IbLCYb蛋白的二級結構由α螺旋、β片層、β轉角及無規(guī)卷曲構成，其中占比最多的是無規(guī)卷曲和α螺旋，所占比例分別為41.52%和37.3%，β片層次之，為16.17%，β轉角最少，為4.99%（見圖4A）。其三級結構也表明，IbLCYb蛋白中無規(guī)卷曲和α螺旋最多（見圖4B）。

圖4　IbLCYb蛋白序列二級結構及三級結構預測分析

2.4 甘薯IbLCYb酶切位點分析

用NEBcutter V2.0在線工具對基因序列進行酶切位點的預測，結果顯示基因有多個酶切位點，如Ⅰ、Ⅰ等（見圖5）。該結果可為后期構建過表達載體提供依據。

圖5　甘薯IbLCYb酶切位點預測

2.5 甘薯IbLCYb的系統進化分析

在NCBI網站對甘薯（）IbLCYb蛋白序列進行BLASTp比對，挑選出9條IbLCYb的同源序列，分別來自煙草（）、番茄（）、馬鈴薯（）、裂葉牽牛（）、三淺裂野牽牛（）、胡蘿卜（subsp.）、甜椒（）、擬南芥（）和歐洲油菜（），用MEGA7.0軟件對上述10條序列進行進化樹分析，其中甘薯與三淺裂野牽牛LCYb序列同源關系最近（見圖6）。

圖6　10個物種LCYb的系統發(fā)育樹

3 討論與結論

甘薯作為我國的一種重要糧食作物，在保障糧食安全方面發(fā)揮著重要作用。甘薯塊根及莖葉中均含有多種生物活性物質，其中β-胡蘿卜素就是重要的活性物質之一，其多烯烴結構具有較強的自由基捕捉能力，因此能很好地清除氧自由基和降低脂質氧化物含量，并明顯改善機體的氧化狀態(tài)[22]。

番茄紅素環(huán)化酶（LYCb）作為β-胡蘿卜素合成途徑中的關鍵酶，其表達量的高低決定了植物組織的顏色。前人對柑橘、番茄、金盞菊、黃花龍膽等植物的研究表明，基因的表達與花和果實中類胡蘿卜素含量呈正相關[23]。在橙色甜瓜中發(fā)現，基因表達量越高，其果實中β-胡蘿卜素的含量越高[24]。王曼曼等的研究表明，在番茄果實著色期，溫度變化能夠抑制基因表達從而影響β-胡蘿卜素的積累[25]。強光顯著誘導小麥基因的表達，其體內的β-胡蘿卜素含量變化與基因表達量的變化相對應[26]。

“普薯32號”又名西瓜紅，是普寧市農業(yè)科學研究所選育的甘薯新品種，該品種薯塊呈紅皮橙心，富含胡蘿卜素，營養(yǎng)價值和保健功能較高[27]。本研究從“普薯32號”中成功克隆到甘薯的基因，其片段大小為1 506 bp，編碼501個氨基酸。利用生物信息學軟件對IbLYCb蛋白進行理化性質和結構分析，發(fā)現其為無跨膜結構域的親水性蛋白，這可能與其在植物體內發(fā)揮的功能相適應。在NCBI上搜索不同物種的LYCb序列并構建發(fā)育進化樹，結果顯示甘薯的LYCb的氨基酸序列與其近緣野生種三淺裂野牽牛的LYCb親緣關系最近，表明甘薯的LYCb可能與三淺裂野牽牛的LYCb具有相似的功能和作用機制。這些結果為進一步研究IbLYCb的功能以及β-胡蘿卜素的合成機制提供理論基礎。

[1]馬代夫.我國甘薯產業(yè)發(fā)展若干問題的思考[J].農業(yè)工程技術(農產品加工業(yè)),2013(11):21-24.

[2]馬琴燕.淺談寧洱鎮(zhèn)黃心甘薯產業(yè)發(fā)展前景及對策[J].農業(yè)開發(fā)與裝備,2014(8):12.

[3]肖利貞,王裕欣.名優(yōu)鮮食彩色甘薯品種推介[J].鄉(xiāng)村科技,2015(23):11.

[4]AHRAZEM O,DIRETTO G,ARGANDONA J,et al.Evolutionarily distinct carotenoid cleavage dioxygenases are responsible for crocetin production in Buddleja davidii[J].Journal of Experimental Botany,2017,68(16): 4663-4677.

[5]余凡,趙少丹,葛亞龍,等.β-胡蘿卜素的提取合成分離及在飼料行業(yè)的應用[J].飼料研究,2014(7):34-39.

[6]王典,楊帆,李國棟.β-胡蘿卜素功能及其在奶牛上的應用進展[J].中國奶牛,2022(3):16-20.

[7]盛保偉,楊一恭.天然β-胡蘿卜素發(fā)酵法研究進展[J].生物技術世界,2014(9):62.

[8]李建喜,方澤華.β-胡蘿卜素的合成路線研究進展[J].廣東化工,2017,44(9):176-177.

[9]AHRAZEM O,GOMEZ-GOMEZ L,RODRIGO M J,et al.Carotenoid cleavage oxygenases from microbes and photosynthetic organisms:features and functions[J].Int-ernational Journal of Molecular Sciences,2016,17(11): 1781.

[10]曲蕙名,王瑩,楚杰,等.β-胡蘿卜素抗氧化作用的研究[J].飼料工業(yè),2018,39(2):9-14.

[11]劉冬松,邵劍鋼,韓培濤,等.β-胡蘿卜素在高原功能食品中的應用[J].食品研究與開發(fā),2015,36(13):147-149.

[12]KIM S H,AHN Y O,AHN M J,et al.Down-regu-lation of β-carotene hydroxylase increases β-carotene and total carotenoids enhancing salt stress tolerance in transgenic cultured cells of sweetpotato[J].Phytoch-emistry,2012,74: 69-78.

[13]KIM S H,JEONG J C,PARK S,et al.Down-regula-tion of sweetpotato lycopene β-cyclase gene enhances tolerance to abiotic stress in transgenic calli[J].Molecular Biology Reports,2014,41:8137-8148.

[14]COLLINS A R.Oxidative DNA damage, antioxida-nts, and cancer[J].BioEssays,1999,21(3):238-246.

[15]YE X,AL-BABILI S,KL?TI A,et al.Engineering the provitamin A (beta-carotene) biosynthetic pathway into (carotenoid-free) rice endosperm[J].Science,2000,287(54 51): 303-305.

[16]王紫璇,李佳佳,于旭東,等.高等植物類胡蘿卜素生物合成研究進展[J].分子植物育種,2021,19(8):2627-2637.

[17]SKELTON R L,YU Q Y,SRINIVASAN R,et al. Tissue differential expression of lycopene beta-cyclase gene in papaya[J].Cell Research,2006,16(8):731-739.

[18]PANDURANGAIAH S,RAVISHANKAR K V, SHIVASHANKAR K S,et al.Differential expression of carotenoid biosynthetic pathway genes in two contr-asting tomato genotypes for lycopene content[J].Journal of Biosc-iences,2016,41(2):257-264.

[19]RONEN G,CARMEL-GOREN L,ZAMIR D,et alAn alternative pathway to beta-carotene formation in plant chromoplasts discovered by map-based cloning of beta and old-gold color mutations in tomato[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2000,97(20):11102-11107.

[20]張亞卿.琯溪蜜柚色澤突變體類胡蘿卜素代謝特征分析[D].武漢:華中農業(yè)大學,2013.

[21]楊永霞,張嘉煒,張洪映,等.過表達基因對煙草類胡蘿卜素代謝及香氣物質的影響[J].中國煙草學報,2016,22(3):94-100.

[22]楊德孟.β-胡蘿卜素對紫蘇油抗氧化活性及其穩(wěn)定性研究[D].寧波:寧波大學,2020.

[23]李晶,竇潤秋,周棟,等.不同果肉顏色蜜柚番茄紅素環(huán)化酶基因的表達分析[J].東南園藝,2018,6(1):13-16.

[24]趙軍林,于喜艷,王秀峰.橙色果肉甜瓜β-胡蘿卜素積累的分子機理[J].山東農業(yè)科學,2014,46(5):7-11,30.

[25]王曼曼,薛舒丹,吳廷全,等.光照和溫度調控對番茄果實中類胡蘿卜素合成的影響[J].分子植物育種,2020,18(18):6158-6164.

[26]ZENG J,WANG C,CHEN X,et al.The lycopene β-cyclase plays a significant role in provitamin A biosynth-esis in wheat endosperm[J].BMC Plant Biology,2015,15 (1):112.

[27]黃景煌.“普薯32號”特征特性及高產栽培技術[J].福建熱作科技,2022,47(3):61-62,66.

10.3969/j.issn.2095-1205.2023.01.12

S531

A

2095-1205(2023)01-37-06

國家青年科學基金項目（31900450）；山西農業(yè)大學科技創(chuàng)新基金項目（2018YJ28）；山西省回國留學人員科研資助項目（2022- 094）

唐銳敏（1990— ），女，漢族，山西長治人，博士研究生，副教授，研究方向為薯類作物次生代謝機制。