RBP、miR-126、Sirt1在急性腦梗死中的表達及與頸動脈粥樣硬化斑塊穩定性的相關性

劉梓宸 ，李克嬌*，暢 莎，宋 雪，李 芳

(1.河北省廊坊市第四人民醫院神經內二科，河北 廊坊 065700；2.河北省廊坊市第四人民醫院檢驗科，河北 廊坊 065700)

急性腦梗死指腦動脈血管粥樣硬化形成斑塊，脫落后阻塞血管、血流中斷或減少引起的腦組織壞死，是臨床常見的腦血管疾病[1-3]，近年來其發病率呈增加趨勢，該病致殘率及致死率高，嚴重影響患者的生活和生命安全[4]。研究指出，高血壓、高血脂、高血糖等是急性腦梗死、頸動脈粥樣硬化斑塊的影響因素，其參與急性腦梗死的病情進展[5]。因而，發掘與斑塊穩定性有關的標志物對急性腦梗死的診斷、治療及評估具有重要意義。相關研究指出，血清視黃醇結合蛋白(retinol binding protein，RBP)、微小核糖核酸126(microRNA-126，miR-126)及沉默信息調節因子1(silent information regulator 1，Sirt1)與頸動脈粥樣硬化斑塊的穩定性存在關聯，并且在急性腦梗死的發生發展中發揮作用[6-8]。本研究旨在探索急性腦梗死患者血清RBP、miR-126、Sirt1水平變化，并分析其水平變化與頸動脈粥樣硬化斑塊穩定性的相關性，為急性腦梗死的診斷及治療、評估提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年5月—2021年7月來我院就診的急性腦梗死患者140例為病例組，另選同期健康體檢者60例為對照組，病例組患者行彩色多普勒超聲檢查，據超聲結果分為穩定斑塊組(n=78)和不穩定斑塊組(n=62)。納入標準：①患者經CT、MRI檢查且符合急性腦梗死診斷標準[9]；②發病24 h內入院；③精神狀態良好能正常配合研究；④患者臨床資料完整；⑤患者及其家屬均知情同意。排除標準：①心血管疾病者；②癌癥患者；③免疫系統疾病。病例組、對照組一般資料差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

表1 2組研究對象一般資料比較Table 1 Comparison of general data of study subjects between two groups

本研究經醫院倫理委員會批準，且患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1頸動脈超聲檢查 采用美國GE-LOGZQ5彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率7.5～12 MHz。患者取平臥位，于肩下墊軟枕，將頭部偏向一側，充分暴露頸部，觀察頸動脈內膜結構、光滑程度、增厚情況、斑塊形態、位置、大小、內部回聲、血流等情況，測量雙側頸動脈和分叉處及顱外段頸動脈內中膜厚度，取平均值為最終頸動脈內中膜厚度[10]。

1.2.2MRI檢測 采用荷蘭皇家Philips Achieva TX3.0T MR成像系統，32通道高分辨頭顱線圈，對血管定位，確定血管分叉處，在頸動脈分叉處分別向上、下各擴展1.6 cm行橫斷掃描及冠狀面掃描[10]。

1.2.3斑塊穩定性判斷 根據頸動脈超聲及MRI進行判斷。若為軟斑塊或潰瘍斑塊，伴隨斑塊內出血、纖維帽破裂即為不穩定斑塊；扁平斑塊或硬斑塊即為穩定斑塊[11]。

1.2.4血清RBP、Sirt1表達檢測 收集2組研究對象清晨空腹靜脈血5 mL，HC-2066高速離心機(北京東南儀誠實驗室設備有限公司) 3 500 r/min離心10 min，分離上清，酶聯免疫吸附試驗檢測血清RBP(K6110，廣東固康生物科技有限公司)、Sirt1(SEE912Hu-96T，北京博爾優生物技術有限公司)表達水平，按試劑盒說明書操作，多功能酶標儀(昆明贊納生物科技有限公司)檢測。

1.2.5血清miR-126表達檢測 Trizol提取血清總RNA，加Trizol與樣品比例3∶1，混勻，靜置5 min，加200 μL氯仿，靜置，離心，取上層RNA，加異丙醇，靜置，離心，留沉淀，加75%無水乙醇離心，棄上清，室溫干燥RNA10 min，加DEPC水溶解RNA，測定RNA濃度及純度，RNA逆轉錄為cDNA，反應條件為：42 ℃ 2 min，去除DNA，反轉錄應條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，反應結束后，將cDNA放在-20 ℃冰箱備用，引物序列見表2。實時熒光定量PCR，U6為內參基因，2-△△Ct法計算miR-126的相對表達量，重復3次。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.3統計學方法 應用SPSS 21.0軟件進行統計分析。計量資料采用比較t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗， Spearman相關性分析RBP、miR-126、Sirt1表達與頸動脈粥樣硬化斑塊穩定性的關系；ROC曲線分析RBP、miR-126、Sirt1表達對頸動脈粥樣硬化斑塊穩定性的預測價值。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1病例組與對照組研究對象血清RBP、miR-126、Sirt1表達 與對照組相比，病例組患者血清RBP表達增加，miR-126、Sirt1表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 2組血清RBP、miR-126、Sirt1表達Table 3 Expression of serum RBP, miR-126 and Sirt1 between two groups

2.2穩定斑塊組和不穩定斑塊組血清RBP、miR-126、Sirt1表達 與穩定斑塊組相比，不穩定斑塊組血清RBP表達增加，miR-126、Sirt1表達降低(P<0.05)，見表4。

表4 2組血清RBP、miR-126、Sirt1表達水平Table 4 Expression levels of serum RBP, miR-126 and Sirt1 between two groups

2.3Spearman相關性分析 血清RBP表達與頸動脈粥樣硬化斑塊穩定性存在正相關關系(P<0.05)，血清miR-126、Sirt1表達與頸動脈粥樣硬化斑塊穩定性存在負相關關系(P<0.05)，見表5。

表5 Spearman相關性分析Table 5 Analysis of Spearman correlation results

2.4ROC曲線分析 血清RBP、miR-126、Sirt1單獨及聯合表達對頸動脈粥樣硬化斑塊穩定性的預測價值：RBP、miR-126、Sirt1及聯合預測的AUC為0.746、0.798、0.712、0.892，敏感度為59.7%、75.8%、75.8%、74.2%，特異度為84.6%、70.5%、64.1%、92.3%，見表6，圖1。

表6 ROC曲線結果分析Table 6 Analysis of ROC curve results

圖1 血清RBP、miR-126、Sirt1單獨及聯合表達對頸動脈粥樣硬化斑塊穩定性的預測價值Figure 1 Predictive value of serum RBP, miR-126, and Sirt1 expression alone and in combination for the stability of carotid atherosclerotic plaques

3 討 論

腦血管疾病是全球疾病負擔的第3位疾病，根據《2018中國衛生健康統計提要》報告顯示，2017年我國農村和城市腦血管疾病病死率分別為23.18%和20.52%，約每5例腦血管疾病患者中有1例死亡[12]。急性腦梗死是腦血管疾病的常見類型。文獻指出，約七成腦梗死患者存在單側頸動脈粥樣硬化，約六成腦梗死患者存在雙側頸動脈粥樣硬化；通過手術去除頸動脈粥樣硬化病變組織后，患者發生腦梗死的概率大大降低，提示著頸動脈粥樣硬化斑塊易損結構破裂、血小板聚集形成血栓是腦梗死的主要危險因素[13]。頸動脈粥樣硬化斑塊可通過超聲檢查區分為穩定性斑塊與不穩定性斑塊，其中穩定性斑塊的炎性細胞少且纖維多，不易破裂；而不穩定性斑塊炎性細胞較多且質地柔軟，新生成的微血管多，容易破裂，進而促進急性腦梗死的病情進展，所以，對斑塊穩定性的檢測有助于急性腦梗死的預防和治療。目前，臨床常采用彩色多普勒超聲檢查來判斷、評估患者的頸動脈粥樣硬化，但該方法對斑塊穩定性的診斷較差[14]，因此，探索與頸動脈粥樣硬化斑塊穩定性相關的指標對急性腦梗死的診斷、治療及評估具有重要意義。目前關于RBP、miR-126、Sirt1與頸動脈粥樣硬化斑塊穩定性的研究較多，但國內尚未有其聯合預測頸動脈粥樣硬化斑塊穩定性的報道，所以本研究檢測患者與健康者RBP、miR-126、Sirt1表達水平波動情況，分析其對頸動脈粥樣硬化斑塊穩定性的預測價值。

研究表明，RBP可抑制PI3K酶活性，對胰島素相關通路產生影響，導致胰島素抵抗，進而引起機體高血糖，形成高胰島素血癥，刺激血管平滑肌增殖，促進動脈粥樣硬化斑塊形成[15]。本試驗中檢測研究對象RBP水平發現，病例組患者血清RBP表達較對照組增加，且不穩定斑塊組血清RBP表達較穩定斑塊組增加，Spearman相關性分析的結果表明，RBP與頸動脈粥樣硬化斑塊穩定性呈正相關，ROC曲線也指出，RBP對頸動脈粥樣硬化斑塊穩定性均有較好的預測價值。這可能是因為RBP在肝臟中合成，可以引起肝臟脂肪酸代謝異常，加劇患者胰島素抵抗，另外RBP水平升高可引起血管的氧化應激反應，刺激炎性因子的生成及釋放，引起血管損傷，促進動脈粥樣硬化的發生及發展，這一點在何偉等[16]、張海燕等[17]的研究中也有提到。

miR-126是內皮細胞特異性的miRNA，研究表明[18]，機體miR-126水平降低會損傷血管的完整性，減少新血管生成，改變血管正常形態與功能。還有研究指出[19]，miR-126與血管損傷及動脈粥樣硬化斑塊相關，miR-126在凋亡小體內運轉，對血管細胞發揮旁分泌作用，刺激血管細胞產生趨化因子基質細胞衍生因子1，減少炎性細胞，形成穩定斑塊，這表示其具有抗頸動脈粥樣硬化作用。研究結果表明，病例組患者血清miR-126表達較對照組降低，不穩定斑塊組血清miR-126表達也較穩定斑塊組降低，Spearman相關性分析指出，miR-126與頸動脈粥樣硬化斑塊穩定性呈負相關，ROC曲線表明，miR-126對頸動脈粥樣硬化斑塊穩定性均有較好的預測價值。這在范翥元等[20]的研究中也有提到。

Sirt1是去乙酰化酶，可與wnt、Notch等信號通路中的蛋白相互作用，維持基因組和染色體穩定性，參與神經保護、炎癥反應、氧化應激及細胞生物學行為等過程。研究表明Sirt1可以抑制低密度脂蛋白受體1的水平，降低氧化型低密度脂蛋白攝取，降低泡沫細胞數量，起到抗頸動脈粥樣硬化作用[21]。本研究結果表明，病例組患者血清Sirt1表達較對照組降低，不穩定斑塊組血清Sirt1表達也較穩定斑塊組降低，Spearman相關性分析指出，Sirt1與頸動脈粥樣硬化斑塊穩定性呈負相關，ROC曲線表明，Sirt1對頸動脈粥樣硬化斑塊穩定性均有較好的預測價值。這是因為Sirtl可減輕內皮細胞氧化應激反應，促進內皮型NO合酶表達，保護內皮細胞功能；此外，Sirtl可催化NF-κB去乙酰化，抑制其活性，減少等炎癥因子的產生，減輕炎癥反應病理損傷，保護內皮細胞，這一觀點在唐宇姣等[22]的研究也有提到。

綜上所述，急性腦梗死患者血清RBP表達增加，miR-126、Sirt1表達降低，可能參與急性腦梗死患者頸動脈粥樣硬化斑塊形成與發展，進而與急性腦梗死的病情進展相關，且RBP、miR-126、Sirt1聯合對頸動脈粥樣硬化斑塊穩定性具有較好預測價值，所以監測急性腦梗死患者RBP、miR-126、Sirt1對急性腦梗死的及時干預與治療具有重要意義。但本研究也存在一定的局限性，一方面，本研究納入的病例來源較為單一且數量較少，研究結果缺乏廣泛性；另一方面，血清RBP、miR-126、Sirt1水平與急性腦梗死及頸動脈粥樣硬化斑塊穩定性相關的機制通路尚不明確，所以，還需擴大病例來源，增加病例數進行更深層次地探索。