外泌體源性非編碼RNA在糖尿病視網膜病變中的診斷價值

李梓萌,劉宇龍

(吉林大學中日聯誼醫院 1.內分泌代謝科;2.骨科,吉林 長春130033)

糖尿病視網膜病變(Diabetic Retinopathy,DR)是糖尿病最常見和嚴重的并發癥,已經成為成人失明和視覺損傷的主要原因[1]。DR早期常常沒有任何癥狀,隨著疾病的進展,可以出現不同程度的視力缺失且不可逆轉[2]。目前DR尚無早期診斷和治療方法[3],晚期治療手段也較少且存在爭議[4]。因此,對DR的早篩查、早診斷、早治療已成為目前臨床中亟需解決的問題[3]。外泌體源性非編碼RNA(non-coding DNA,ncRNA)近年來被認為有望成為疾病極具潛力的生物標志物[5-6]。目前已有成熟的肝癌、胰腺癌相關miRNA檢測試劑盒,但是在DR領域尚無明確研究成果。因此,明確外泌體源性非編碼RNA在糖尿病視網膜病變中的診斷價值具有重大意義。

1 糖尿病視網膜病變流行病學及診斷現狀

據統計,在全球糖尿病患者中,糖尿病視網膜病變的發生率為22.27%,2020年DR患者約有1.0312億,預計2045年將達到1.605億[2]。糖尿病視網膜病變主要分為非增殖期(Non-proliferative Diabetic Retinopathy,NPDR)及增殖期(Proliferative Diabetic Retinopathy,PDR)。早期特點是視網膜上血管內皮細胞和周細胞的進行性丟失以及連接蛋白的緩慢溶解,導致血管滲透性增加和視網膜黃斑水腫;晚期特點是炎癥細胞浸潤、組織破壞和新生血管形成,進一步引起玻璃體積血及牽拉性視網膜脫離[1]。眼底熒光素血管造影(Fundus fluorescein angiography,FFA)是診斷DR的金標準[2],但其為侵入性檢查,此外尚有檢眼鏡檢查、彩色眼底照相和光學相干斷層掃描等方法[2],但因無法發現早期病變、容易漏診細微病變、對醫生的診斷水平要求很高等缺點限制了臨床應用。近年來的研究表明,在DR的病程進展中,神經退行性病變早于微血管改變[7]。因此,需要更有效的檢測手段早期預測或發現糖尿病視網膜病變并進行早期干預。

2 外泌體源性非編碼RNA在糖尿病視網膜病變中的診斷價值

2.1 外泌體源性非編碼RNA作為生物標志物在疾病診斷中的優勢

外泌體是一種細胞外泌性囊泡,可由多種細胞產生并釋放入細胞外空間,廣泛存在于血液、尿液、唾液等各種生物體液中,富含核酸(miRNA、lncRNA、circRNA、mRNA、tRNA等)、蛋白質、脂質等[8]。外泌體作為細胞間通訊的重要媒介,攜帶和傳遞重要的信號分子,廣泛參與細胞間物質運輸和信息傳遞,調節細胞生理活動,與多種疾病的發生和發展密切相關[8]。其良好的生物相容性及穿越生物屏障的能力保證了內容物的完整性和活性。ncRNA如lncRNA、miRNA、circRNA等主要參與轉錄后調控,可以在外泌體的保護下免受體液中RNA酶的降解而穩定存在,隨外泌體循環并被鄰近或遠處的細胞攝取,參與受體細胞的增殖、分化、遷移等活動,調控疾病的發生和進展[5]。lncRNA、circRNA還能充當競爭性內源RNA(ceRNA)或者RNA海綿,通過抑制miRNA活性來調節靶基因表達[9]。疾病發生時,組織中特異性外泌體釋放入外周血,致使循環中ncRNA的表達譜發生改變,其變化出現在疾病的早期階段并可以被高效、定量檢測出來,比常規檢查具有更高的敏感性和特異性。此外,循環miRNA等在體內可以存活很久(接近2周)[10],并且在體外各種不同的環境下能夠穩定存在,可以抵抗不同的pH、溫度、氣壓及核糖核酸酶RNases,甚至可以在反復凍融條件下穩定存在、高效恢復并可以被高效、定量檢測出來。因此,近年來外泌體源性ncRNA憑借其穩定性、普遍性、高特異性、高靈敏度,被認為可以成為疾病極具潛力的非侵入性生物標志物[8]。

2.2 外泌體源性非編碼RNA作為糖尿病視網膜病變生物標志物的研究現狀

糖尿病視網膜病變發生時存在大量異常表達的ncRNA,它們可以選擇性地透過血-視網膜屏障[11],影響炎癥應答、胰島素信號通路和血管生成[12],與視網膜細胞的增殖、遷移、凋亡有很重要的關系[10]。外泌體源性ncRNA可以轉移到靶細胞或靶器官調節基因表達,也可以在其囊泡結構保護下穩定儲存在循環液中,因此,它們可以作為反映疾病進展的生物標志物[6]。大量研究表明外泌體源性ncRNA有望成為DR早期診斷的生物標志物及治療靶點[8],如miR-202-5p、miR-15a、miR-20a-5p、miR-20a-3p、circ-Ehmt1、circ-0005015、lncRNA SNHG7等。但是目前國內外非編碼RNA與DR的相關研究中,以細胞、動物研究居多,臨床研究較少且多采用qRT-PCR或基因芯片進行候選驗證,無法尋找最有意義的ncRNA分子,僅有少數研究采用高通量測序進行全基因組篩選但樣本數極少(僅為個位數)。

2.2.1外泌體源性miRNA作為糖尿病視網膜病變生物標志物的研究現狀 miRNA是內源性非編碼單鏈小分子RNA,長度約為19～24個核苷酸[2],在人類所有類型細胞中都有表達,參與了機體幾乎所有的病理生理過程,如細胞增殖、分化、凋亡等[6]。外泌體源性miRNA進入靶細胞后,可直接與特定靶mRNA的3’-非翻譯區(3’-untranslated region,3’-UTR)相結合,通過降解靶mRNA或抑制其翻譯,在轉錄后水平調控基因蛋白質的表達。外泌體源性miRNA也可以與lncRNA等“海綿”結合,發揮生理調節作用[6]。近來研究報道了外泌體源性miRNA在DR發展中的重要作用,特別是在視網膜細胞功能障礙中[6]。如KAMELDEN等證明[13]胰腺β細胞來源的外泌體源性miR-15a可以進入血液并通過靶向AKT3促進視網膜Müller細胞的凋亡,MAISTO[14]等報道高糖水平可以降低原代視網膜細胞釋放的外泌體中抗血管生成的miRNA(如miR-106a-5p、miR-20a-5p和miR-20a-3p)的水平,以調節VEGF的表達,從而促進視網膜光感受器的損傷。目前許多臨床研究發現DR患者血清中外泌體源性miRNA顯著升高,可作為DR診斷的生物標志物,具有較高的診斷效力,不僅可以用來診斷DR,還可以區分增殖期與非增殖期。如LIU等[15]通過qRT-PCR及ROC曲線發現與與健康對照組相比miR-425p診斷DR的AUC值為0.907 2,敏感度91.7%,特異度84%,與2型糖尿病患者相比其診斷的AUC值為0.833,敏感度85.7%,特異度78%;用來區別增殖期和非增殖期的AUC值為0.802,敏感度94.5%,特異度71.1%。WANG等[16]通過qRT-PCR及ROC曲線發現miR-374a用來診斷DR的AUC值為0.892,敏感度為82.9%,特異度為80.29%,用來區別增殖期和非增殖期的AUC值為0.807,敏感度為84.2%,特異度為78.83%。

2.2.2外泌體源性lncRNA作為糖尿病視網膜病變生物標志物的研究現狀 長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是轉錄本長度大于200nt的非編碼RNA[17]。在表觀遺傳、轉錄和翻譯水平上調控基因表達和蛋白質形成,并影響細胞增殖、凋亡、免疫反應和氧化應激[17]。近來研究表明,lncRNA MALAT1、lncRNA MEG3、lncRNA MIAT、lncRNA H19、lncRNA HOTAIR、lncRNA BANCR、lncRNA SNHG16等可通過PI3K-Akt、SIRT1、P38 MAPK、TGF-β、Nrf2等通路參與DR的進展[17]。研究表明lncRNA MALAT1在DR神經變性、炎性反應、血管新生方面發揮了一定的致病作用[9,18-19],DR患者血清中MALAT1表達上調,可作為DR早期診斷及嚴重程度的無創生物標志物[20],MALAT1下調將明顯改善糖尿病視網膜周細胞丟失、毛細血管變形、微血管滲漏、炎癥及視網膜光感受器損害所致的糖尿病神經變性[21,17],減輕氧化應激損傷,延緩DR的病程進展[22]。lncRNA PPT2-EGFL8在DR患者外周血中表達明顯下降,miR-423-5p明顯上升,PPT2-EGFL8通過分子海綿作用吸收miR-423-5p,抑制缺氧誘導的人視網膜微血管內皮細胞增殖[23]。血漿外泌體lncRNA DLX6-AS1和PRINS二者聯合診斷DR的AUC值為0.813,有望作為DR的診斷標志物[24]。BISWAS等在患者血清中檢測了9個lncRNAs(ANRIL、MALAT1、WISPER、ZFAS1、H19、HOTAIR、HULC、MEG3和MIAT),通過ROC和進一步分析,確定了lncRNA聯合應用可以用來診斷篩查DR患者[25]。

2.2.3外泌體源性circRNA作為糖尿病視網膜病變生物標志物的研究現狀

與傳統的線性RNA不同,circRNA是一種特殊類型的非編碼RNA,其分子呈封閉環狀結構,不受RNA外切酶影響,表達更為穩定[26]。circRNA已成為繼miRNA和lncRNA之后,ncRNA研究領域的新熱點,可以通過影響RNA聚合酶鏈長度、作為miRNA海綿調節靶基因表達、與RNA結合蛋白相互作用調節翻譯過程等方式調節各種細胞活動[27]。越來越多研究表明circRNA如circHIPK3、circRNA cZNF609等可通過調節視網膜血管內皮細胞的生長、增殖、遷移等在DR疾病進程中發揮重要作用[27]。有研究通過芯片發現糖尿病視網膜組織中529個circRNA異常表達,通過qRT-PCR驗證了DR患者外周血中circ_0005015高表達,可作為DR診斷的生物標志物,其可通過調節內皮細胞增殖、遷移等調控視網膜內皮血管生成,可作為miR-519d-3p海綿抑制其表達并增加MMP-2、XIAP、STAT3的表達[28];有研究通過測序和qRT-PCR發現hsa_circ_0001953在PDR患者中明顯升高,ROC曲線顯示其與NPDR患者和對照組相比有較高診斷準確率,AUC值分別為0.87和0.92[29]。最新有研究通過對患者血清外泌體中分離的總RNA進行測序發現circMKLN1在DR中異常高表達,在鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病小鼠模型中通過AAV2轉導抑制cricMKLN1可顯著改善視網膜血管滲漏,在人視網膜內皮細胞(hRECs)中發現circMKLN1可作為分子海綿吸附miR-26-5p,調節高糖/甲基乙二醛介導的自噬[30]。

3 總結與展望

綜上所述,需要通過更多臨床研究發現最有診斷價值的外泌體源性ncRNA,并通過細胞、動物研究解析ncRNA在DR發生發展中的重要作用,以期將外泌體源性ncRNA作為DR早期診斷的生物標志物,達到對疾病的預防、早篩及早干預,為臨床上DR的早期診斷及治療提供一定的幫助。