苦蕎小曲酒半固態發酵工藝優化及揮發性風味成分分析

曹新志，宋澤麗，胡 琴，趙迎慶，張楷正

（1.宜賓四川輕化工大學產業技術研究院，四川 宜賓 644000；2.四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓 644000；3.中化（臨沂）作物營養有限公司，山東 臨沂 271000）

苦蕎（Fagopyrum tataricum）是一種優質的藥食兩用谷物資源[1-2]，其植株適應性強，種植范圍廣，是醫藥和食品的優質谷物來源[3-4]。黃酮類化合物是苦蕎中最重要的生物活性成分，具有抗氧化、抗糖尿病和降膽固醇等多種功效[5-6]。苦蕎中淀粉含量高，占總干質量的70%左右[5]，是發酵釀造的理想原料。

苦蕎因其豐富的營養物質及生物活性成分，受到國內外學者的廣泛關注[7]。在食品和醫藥方面，都有不少的加工產品，苦蕎饅頭、苦蕎面和苦蕎茶等常見于日常生活中[8-10]。其中以苦蕎作為發酵原料釀造的醋[9]、啤酒[11]、酸奶[12]等產品兼具有苦蕎特征性風味及高營養價值[13]。作為小曲酒釀造研究國之一，我國學者已在苦蕎小曲酒釀造方面進行了許多研究，萬萍等[14]通過對酒曲和打量水的用量及糧糠比和發酵時間的研究對固態法釀造苦蕎酒的工藝進行了初探；李園園[15]以苦蕎米為原料，采用液態法對糖化及發酵工藝進行優化，使淀粉轉化率和酒精度得以提高。但鮮有人研究半固態發酵工藝釀造苦蕎小曲酒。

本研究以苦蕎為原料，采用半固態發酵方法釀造苦蕎小曲酒，并采用單因素試驗及正交試驗從不同料水比、發酵溫度和發酵時間對苦蕎小曲酒半固態發酵工藝進行研究，確定最優工藝條件，并采用氣質聯用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）測定苦蕎小曲酒揮發性風味成分。以期為今后苦蕎小曲酒的研究和生產提供一定的數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎：四川省涼山彝族自治州；小曲：重慶市合川區鑫星曲藥廠；酒石酸鉀鈉、五水硫酸銅、氫氧化鈉、葡萄糖、亞鐵氰化鉀、鹽酸、鄰苯二甲酸氫鉀、硫酸、無水乙醇（均為分析純）：成都市科隆化學品有限公司。

1.2 儀器與設備

HWS-12電熱恒溫水浴鍋：上海齊欣科學儀器有限公司；H01-1數顯恒溫磁力攪拌器：上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；DL-1電子萬用爐：北京市永光明醫療儀器有限公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科技有限公司；GZ-250-S生化培養箱：韶關市廣智科技設備有限公司；AR1140電子天平：奧豪斯國際貿易（上海）有限公司；Thermo 868 pH計：熱電（上海）科技儀器有限公司；TSQ8000氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀：美國Thermo公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 苦蕎小曲酒的釀造工藝流程及操作要點

操作要點：

原料處理、泡糧：選擇顆粒飽滿，無霉粒的優質苦蕎，苦蕎按料水比1∶3（g∶mL），以先水（水溫60 ℃）后糧的順序加入泡糧容器中，由邊緣先內部翻拌苦蕎一次，刮平，過程中不再攪拌，避免產酸，浸泡4 h。

蒸糧、出甑：將浸泡好的苦蕎瀝去水分，倒入甑內，圓氣后加蓋蒸40 min，蒸熟的苦蕎飽滿，手捏軟綿，無硬心。

攤晾、拌小曲：將蒸熟的苦蕎取出放于攤晾盤中，攤涼至40 ℃左右加入苦蕎質量0.6%的小曲。

培菌糖化：將拌好小曲的糧醅置于白瓷盤中蓋上紗布，于30 ℃條件下糖化25 h。在2 h內完成攤晾、拌曲和上箱，以防止雜菌的感染，以免影響培菌。

半固態發酵：糖化完成后，將糧醅裝入5 L白酒發酵罐封口發酵，按料水比1∶1.5（g∶mL）加水混合均勻，于28 ℃恒溫發酵9 d。

蒸餾：采用液態蒸餾法，保證摘酒溫度維持在25 ℃以下，掐頭去尾接酒，得到原酒。

1.3.2 苦蕎小曲酒半固態發酵工藝優化單因素試驗

通過出酒率、總酸含量、總酯含量及感官評分進行判定，分別考察料水比（1.0∶0.5、1.0∶1.0、1.0∶1.5、1.0∶2.0、1.0∶2.5（g∶mL）），發酵時間（5 d、7 d、9 d、11 d、13 d），發酵溫度（24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃）3個因素對苦蕎小曲酒品質的影響，探究最佳釀造工藝條件。

1.3.3 苦蕎小曲酒半固態發酵工藝優化正交試驗

在單因素試驗結果的基礎上，以出酒率為評價指標，采用3因素3水平L9（33）正交試驗對料水比（A）、發酵時間（B）和發酵溫度（C）進行優化，確定苦蕎小曲酒的最佳半固態發酵條件，正交試驗因素與水平見表1。

表1 苦蕎小曲酒半固態發酵條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for semi-solid fermentation conditions optimization of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu

1.3.4 理化指標測定

總固形物含量的測定：參照《釀酒分析與檢測》[16]中的方法；酒精度的測定：參考GB/T 10345—2007《白酒分析方法》[17]中的酒精計法；總酸、總酯的測定：參考GB/T 10345—2007《白酒分析方法》[17]中的指示劑法。

1.3.5 原料出酒率的計算

1.3.6 感官評定

由12位前期經過白酒品評訓練的專業人員依據DBS52/005—2014《小曲清香型白酒》[18]進行感官評定，感官評分標準見表2，取12人的平均分，滿分100分。

表2 苦蕎小曲酒的感官評分標準Table 2 Sensory scoring standards of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu

1.3.7 苦蕎小曲酒揮發性風味成分分析

苦蕎小曲酒中揮發性風味成分測定采用GC-MS法。分析條件設定見參考文獻[19]。揮發性產物的定性、定量分析參照文獻[20]。

2 結果與分析

2.1 苦蕎小曲酒半固態發酵工藝優化單因素試驗

2.1.1 料水比對苦蕎小曲酒品質的影響

不同料水比對苦蕎小曲酒出酒率和感官評價的影響見圖1。由圖1可知，隨著料水比的變化，苦蕎小曲酒出酒率和感官評分呈先升高后降低的趨勢，料水比為1.0∶1.5（g∶mL）時出酒率和感官評分均為最高，分別為（57.54±0.30）%、（82.37±0.50）分。這可能是因為水分太少會抑制酵母的生產繁殖，以致于出酒率不高、而水分含量太高，則會稀釋酒精度，從而降低出酒率。因此，選取料水比為1.0∶1.5（g∶mL）為宜。

圖1 不同料水比對苦蕎小曲酒出酒率和感官評分的影響Fig.1 Effect of different material and water ratios on the liquor yield and sensory score of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu

不同料水比對苦蕎小曲酒總酸和總酯含量的影響見圖2。由圖2可知，隨著料水比的減小，苦蕎小曲酒總酸、總酯含量整體呈先略微上升后下降的趨勢。當料水比在1.0∶0.5～1.0∶1.5（g∶mL）范圍內變化時，總酸、總酯含量變化不顯著（P＞0.05），在料水比＜1.0∶1.5（g∶mL）后，總酸、總酯含量下降顯著（P＜0.05）；因此，選取料水比為1∶1.5（g∶mL）為宜。

圖2 不同料水比對苦蕎小曲酒總酸和總酯含量的影響Fig.2 Effect of different material and water ratios on total acids and total esters content of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu

綜合上述分析，確定料水比為1.0∶1.5（g∶mL）。

2.1.2 發酵時間對苦蕎小曲酒品質的影響

不同發酵時間對苦蕎小曲酒出酒率和感官評價的影響見圖3。由圖3可知，隨著發酵時間的延長，苦蕎小曲酒出酒率呈先升高后降低的趨勢，發酵時間9 d時出酒率最高，為（58.56±0.26）%；這可能是因為9 d后酵母進入停滯或衰退期，不再合成酒精，導致出酒率降低。同時，隨著發酵時間的延長，感官評分呈先上升后逐漸趨于平穩的趨勢，發酵時間＞9 d后，變化不顯著（P＞0.05）。因此，選擇發酵時間9 d為宜。

圖3 不同發酵時間對苦蕎小曲酒出酒率和感官評分的影響Fig.3 Effects of different fermentation time on the liquor yield and sensory score of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu

不同發酵時間對苦蕎小曲酒總酸和總酯含量的影響見圖4。由圖4可知，隨發酵時間的延長，苦蕎小曲酒總酸、總酯含量先逐漸增加，發酵時間＞9 d后趨于平穩，變化不顯著（P＞0.05）。這可能由于在發酵過程中隨著微生物的生長繁殖都會產生各種有機酸類物質。因此，選擇發酵時間9 d為宜。

圖4 不同發酵時間對苦蕎小曲酒總酸和總酯的影響Fig.4 Effects of different fermentation time on total acids and total esters of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu

綜合上述分析，確定發酵時間為9 d。

2.1.3 發酵溫度對苦蕎小曲酒品質的影響

不同發酵溫度對苦蕎小曲酒出酒率及感官評價的影響見圖5。由圖5可知，隨著發酵溫度的升高，苦蕎小曲酒出酒率和感官評價均先升高后降低的趨勢。發酵溫度為28 ℃時出酒率和感官評分均為最高，分別為（58.52±0.4）%、（84.75±0.37）分；這是由于過低的溫度使酵母的生長和代謝較緩慢，使其產酒率低，溫度過高使酵母利用還原糖代謝產出酒精的能力下降。因此，選擇發酵溫度28 ℃為宜。

圖5 不同發酵溫度對苦蕎小曲酒出酒率和感官評分的影響Fig.5 Effects of different fermentation temperature on the liquor yield and sensory score of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu

不同發酵溫度對苦蕎小曲酒總酸和總酯含量的影響見圖6。由圖6可知，隨著發酵溫度的升高，苦蕎小曲酒總酸、總酯含量而逐漸增加，當發酵溫度達到28 ℃后則無明顯變化（P＞0.05）。因此，選擇發酵溫度28 ℃為宜。

圖6 不同發酵溫度對苦蕎小曲酒總酸和總酯的影響Fig.6 Effects of different fermentation temperature on total acids and total esters of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu

綜合上述分析，確定發酵溫度為28 ℃。

2.2 苦蕎小曲酒半固態發酵工藝優化正交試驗結果

苦蕎小曲酒半固態發酵條件優化正交試驗結果與分析見表3，方差分析見表4。

表4 正交試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal tests results

由表3可知，3個因素對出酒率高低的影響順序為料水比（A）＞發酵溫度（C）＞發酵時間（B）。通過極差分析得到半固態發酵工藝最佳條件組合為A2B2C2，即料水比1.0∶1.5（g∶mL）、發酵時間9 d、發酵溫度28 ℃。

表3 苦蕎小曲酒半固態發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for semi-solid fermentation conditions optimization of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu

由表4可知，料水比對半固態發酵過程中出酒率有極顯著影響（P＜0.01），發酵溫度對半固態發酵過程中出酒率有顯著影響（P＜0.05），發酵時間對半固態發酵過程中出酒率影響不顯著（P＞0.05）。

將正交試驗中由直觀分析所得的最優組合A2B1C2（對照組）和理論最優組合A2B2C2（驗證組）同時進行5次重復驗證試驗。結果發現，組合A2B1C2出酒率為（58.28±0.26）%，組合A2B2C2出酒率為（58.96±0.39）%，兩組出酒率有顯著性差異（P＜0.05），且理論最優組較高。故選擇最優半固態發酵工藝條件為A2B2C2，即料水比1∶1.5（g∶mL）、發酵時間9 d、發酵溫度28 ℃。

2.3 苦蕎小曲酒部分理化指標分析

對最佳工藝條件下釀造的苦蕎小曲酒進行質量評價，結果見表5。由表5可知，苦蕎小曲酒酒精度為（52.70±0.92）%vol；出酒率為（58.06±0.65）%；總酸和總酯的含量分別為（0.69±0.07）g/L和（2.18±0.19）g/L，總酸和總酯比例協調；經測定基酒中的總固形物含量為（0.09±0.01）g/L；感官評分為（85.33±0.58）分，且每批次釀造出的苦蕎小曲酒的酒體都清亮透明且香味協調，具有乙酸乙酯為主體的協調性復合香氣且伴有苦蕎特有的清香。苦蕎小曲酒的各項理化指標均符合GB/T 26761—2011《小曲固態法白酒》[21]要求。

表5 苦蕎小曲酒部分理化指標分析結果Table 5 Analysis results of some physicochemical indexes of tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu

2.4 苦蕎小曲酒揮發性風味成分分析

采用GC-MS檢測最優工藝條件下生產的苦蕎小曲酒的揮發性風味成分，結果見表6。

表6 苦蕎小曲酒揮發性風味成分GC-MS分析結果Table 6 Results of volatile components in tartary buckwheat Xiaoqu Baijiu analysis by GC-MS

續表

由表6可知，利用GC-MS從苦蕎小曲酒中共檢出53種揮發性風味成分，包括23種醇類物質、19種酯類物質、5種酸類物質、2種醛類物質、3種烴類物質、1種其他類物質。其中酯類化合物和芳香族化合物是最突出的化合物。其中對酒體的主要香型和風格影響最大的就是酯類化合物。它們主要以乙酯的形式存在，賦予小曲酒以果香和花香的感官特征[22]。乙酸乙酯和乳酸乙酯在苦蕎小曲酒中的含量最高。苦蕎小曲酒中的酯類香氣成分主要來自微生物的代謝和生化反應，還有少數是通過酯化反應產生的[23]。醇類化合物中，除乙醇外含量較高的是異戊醇、異丁醇、正丙醇、2-甲基丁醇、正戊醇、乙偶姻、異丁醇。其中異丁醇、異戊醇是雜醇油的主要成分，含量過高會使人頭痛、頭暈等[24]。乙酸是苦蕎小曲酒中含量最高的酸類化合物，達870.95 mg/L，酸類化合物具有維持酯類香氣的作用[25]。

3 結論

本試驗以苦蕎為原料，以小曲為糖化發酵劑，采用半固態發酵法釀造苦蕎小曲酒，采用單因素及正交試驗優化得到最優半固態發酵工藝為料水比1.0∶1.5（g∶mL）、發酵時間9 d、發酵溫度28 ℃。在此條件下發酵的苦蕎小曲酒酒精度為52.7%vol；出酒率為58.06%；總酸和總酯的含量分別為0.69 g/L、2.18 g/L；總固形物含量為0.09 g/L；感官評分為85.33分。采用GC-MS從苦蕎小曲酒中共檢出揮發性成分53種，其中23種醇類物質、19種酯類物質、5種酸類物質、2種醛類物質、3種烴類物質、1種其他類物質。本研究為后續半固態法釀造苦蕎小曲酒的生產和研發提供理論依據和技術參考。