宏基因組二代測序技術對髖/膝關節結核的診斷價值

姚黎明 姚曉偉 董昭良 劉豐勝 王連波 賈晨光

關節感染性疾病是由特定病原微生物感染骨關節所致疾病的統稱。按照感染病原菌的種類可分為特異性感染[結核分枝桿菌(MTB)、布魯氏菌、梅毒螺旋體、真菌]及非特異性感染(金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸埃希菌、克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌等)。近年來，隨著人口老齡化趨勢及易感人群免疫力下降，關節感染性疾病的發病率也在不斷增加，是造成肢體功能障礙和骨關節畸形的原因之一。但此類疾病的早期癥狀缺乏特異性，加之感染病灶病原菌傳統培養陽性率較低，難以獲得明確的病原學結果[1-2]，常被誤診為骨關節病及骨質疏松而被忽略，導致其診斷困難、治療延遲。故早期準確的病原學診斷與有效合理的治療措施尤為重要。

宏基因組二代測序技術(metagenomic next generation sequencing，mNGS)作為一種新興的病原微生物檢測手段，因其較傳統檢測方法具有快速、精準等優勢，已被廣泛應用于臨床感染病原學診斷領域[3-4]。筆者回顧性分析mNGS在髖/膝關節感染性疾病診斷中的應用情況，以探討mNGS對關節結核的診斷價值。

對象和方法

一、研究對象

1.一般資料：采用回顧性研究方法，收集2019年6月至2021年6月河北省胸科醫院收治的34例臨床確診為髖/膝關節感染患者的相關資料。其中，男性16例，女性18例；年齡范圍為8～76歲，平均年齡為(59.32±12.41)歲；左髖8例、右髖10例、左膝8例、右膝8例。主訴為髖關節或膝關節疼痛伴活動受限，其中伴有發熱者12例。入院后常規檢查血紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)范圍為 17～121 mm/1 h(參考值為0～15 mm/1 h)，平均為(66.65±22.00) mm/1 h；C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)范圍為10.18～113.94 mg/L(參考值為0～8 mg/L)，平均為(53.37±16.26) mg/L。根據病史、臨床特點、影像學表現、組織病理學和病原學檢查結果及抗結核治療效果進行臨床綜合診斷，最終16例確診為關節結核，18例為非結核感染性疾病，具體見表1。本研究通過本院醫學倫理委員會審核批準[2019倫審(10號)]，患者均簽署知情同意書。

表1 34例髖/膝關節感染性疾病患者臨床資料

2.納入標準：需同時滿足以下4條標準。(1)臨床存在髖/膝關節感染癥狀及體征；(2)血常規、ESR、CRP均異常，可伴有發熱癥狀；(3)收集足夠的關節液或滑膜組織進行病原菌培養和mNGS檢測，且mNGS檢測出病原體，同時排除穿刺損傷引起的血液污染；(4)影像學表現支持髖/膝關節感染，且抗感染治療有效。

3.排除標準：(1)經臨床表現、實驗室檢查，以及影像學、病原學和病理學檢查等綜合診斷排除髖/膝關節感染；(2)存在取材中標本污染或可疑污染；(3)合并艾滋病等免疫系統或惡性腫瘤等影響檢測結果的疾病。

二、研究方法

1.普通細菌和分枝桿菌培養：所有患者均經過彩色多普勒超聲或CT定位引導下穿刺或手術途徑獲取感染病灶核心部位的膿液、病變滑膜及肉芽組織樣本，分別對組織樣本進行常規普通細菌和分枝桿菌培養。普通細菌采用VITEK-60全自動細菌鑒定系統(法國生物梅里埃公司)進行培養及菌株鑒定；分枝桿菌使用MGIT 960自動MTB培養儀(美國BD公司)進行培養及菌種鑒定。

2.MTB-DNA擴增檢測：將標本同時送分子生物學實驗室行GeneXpert MTB/RIF(簡稱“GeneXpert”)檢測(美國Cepheid公司)。根據應用手冊，將各冰凍病灶標本解凍后，分別取1 ml標本沉淀物加入2 ml 樣本處理液，劇烈振蕩20次，室溫孵育10 min；再次振蕩，室溫孵育5 min，使用新的移液管將2 ml樣本加入試劑匣，將標本置4通道GeneXpert平臺進行自動操作，約2 h后將樣品加入盒子，系統可自動讀取測試結果和利福平耐藥結果。

3.mNGS檢測：主要包括以下步驟：(1)樣本處理和DNA提取：將樣本轉移至含細胞裂解液、玻璃珠及氧化鋯珠的2 ml離心管中。將離心管置于渦旋混合器上，劇烈攪拌20 min。攪拌完成后將樣本轉移至新的離心管并提取DNA。(2)DNA文庫構建和測序：將提取的樣本DNA經超聲破碎為片段、末端修復、適配體連接和PCR擴增后構建DNA文庫，DNA文庫樣本質控采用Agilent 2100生物分析儀和Qubit 2.0熒光計。隨即將通過質控的雙鏈DNA文庫轉化為單鏈環狀DNA。再通過滾環擴增技術生成DNA納米球(DNAnanoball, DNB)。采用Qubit 2.0熒光計對DNB進行質控。將合格的DNB加載至測序芯片上，然后通過高通量測序系統BGISEQ-50平臺進行SE50bp測序，測序數據量為20 M reads。(3)生物信息分析：通過BWA測序分析軟件剔除高質量數據中可比對到人參考基因組序列上的數據。經過上述步驟篩選后的數據在去除低復雜度reads后再與專用的微生物大數據庫比對，并將比對后的數據按照病毒、細菌、真菌和寄生蟲等進行分類和排列。微生物參考全基因組數據，數據全部來源于NCBI。根據序列數的高低及臨床其他檢測來判斷可能的病原體。

4.關節結核的臨床診斷標準：以病原學、病理檢查結果作為關節結核確診依據，也可結合流行病學史、癥狀、體征、影像學及相關輔助檢查進行綜合分析作出臨床診斷[5-7]。符合以下(1)～(6)條中至少4項，同時符合(7)和(8)條中至少1項，即可確診為關節結核。(1)單一關節腫痛、活動受限且合并典型結核全身中毒癥狀；(2)影像學檢查DR顯示，鄰近關節骨量減少或骨質疏松、關節邊緣骨侵蝕、關節間隙變窄；CT掃描顯示軟骨下死骨周圍無硬化及骨膜反應；(3)ESR、CRP、白介素-6等炎性指標明顯增高；(4)結核免疫指標檢測：結核菌素皮膚試驗強陽性、γ-干擾素釋放試驗或結核抗體陽性；(5)系統抗結核治療有效；(6)MTB核酸檢測陽性；(7)MTB培養陽性；(8)穿刺活檢或手術獲取病灶組織為典型結核性肉芽腫。

5.關節非結核感染性疾病臨床診斷標準：符合以下第(5)條，同時(1)～(4)條至少符合1項，即可診斷為關節非結核感染性疾病。(1)臨床表現和影像學檢查診斷關節感染性疾病，實驗室檢查顯示白細胞計數、中性粒細胞計數、CRP、ESR升高；(2)血培養、病灶組織培養陽性；(3)mNGS檢測顯示陽性結果；(4)病理組織學檢查考慮感染性疾病表現，同時未提示MTB感染可能；(5)對可疑病原微生物針對性抗感染治療有效。

三、統計學處理

采用SPSS 20.0軟件進行數據的統計分析。計數資料以“例(百分率，%)”描述，組間差異的比較采用卡方檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。以臨床診斷為參照標準，采用敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、Kappa值等指標評估MGIT 960培養、MTB-DNA擴增檢測和mNGS檢測在骨關節結核診斷中的效能。其中，Kappa值≥0.75表示一致性良好，0.4～0.74表示一致性尚可，<0.4表示一致性不佳。

結 果

一、髖/膝關節感染性疾病患者檢測結果

16例髖/膝關節結核患者中，mNGS累計檢出病原菌20例次。其中，檢出單一MTB 11例次(55.0%)，均為人型MTB；真菌1例次(5.0%)，為曲霉菌；同時有4例合并竇道的患者分別檢測出MTB和另一種病原體(分別為鮑曼不動桿菌、溶血葡萄球菌、金黃色葡萄球菌和嗜麥芽窄食單胞菌各1例)，共計8例次(40.0%)；mNGS對MTB的檢出率為93.8%(15/16)，明顯高于MTB-DNA擴增檢測[50.0%(8/16)]和MGIT 960培養[25.0%(4/16)]，差異均有統計學意義(χ2=7.575，P=0.015；χ2=15.676，P=0.000)。另外，觀察到的MTB菌屬的序列范圍為5～7×104序列數；其中序列數≤1×102有5例，1×102<序列數≤2×104有6例，2×104<序列數≤7×104有5例。

18例髖/膝關節非結核感染性疾病患者，累計檢出病原菌21例次(包括14個菌屬，分別為假單胞菌、黃單胞桿菌、腸球菌、葡萄球菌、鏈球菌、枸櫞酸桿菌、埃希菌、克雷伯菌、棒狀桿菌、擬桿菌、布魯氏菌、希瓦氏菌、鞘氨醇單胞菌、非結核分枝桿菌)；檢出頻次最高的為嗜麥芽窄食單胞菌(6例次)，其次為布魯氏菌(3例次)；其中，1例膝關節感染患者經mNGS檢出膿腫分枝桿菌；11例患者為單一病原體感染[61.1%(11/18)]，7例患者同時檢測出2種及以上病原體[38.9%(7/18)]。觀察到的病原體序列范圍為1×102～8×104序列數，其中1×102<序列數≤2×104有15例，2×104<序列數≤8×104有3例。mNGS對病原體檢出率[100.0%(18/18)]明顯高于常規細菌培養[11.1%(2/18)]，差異有統計學意義(χ2=28.800，P=0.000)。

二、常規培養、MTB-DNA擴增檢測和mNGS對關節結核的診斷效能

結果顯示，mNGS診斷關節結核的敏感度、陰性預測值和Kappa值均明顯高于常規培養和MTB-DNA擴增，具體見表2。

表2 常規培養、MTB-DNA擴增檢測和宏基因組二代測序對骨關節結核的診斷效能

討 論

在關節結核診斷領域，目前實驗室培養仍是關節感染病原菌檢測的常規方法，雖然培養技術在持續優化，但由于關節結核標本難以獲取、樣本含菌量低，仍存在培養陽性率不高、周期較長及診斷效率不高等不足。有研究顯示，關節液或病灶組織MTB的培養陽性率僅為20%～30%[6]，這使得臨床醫生常要面對疑似關節結核卻無法明確致病菌的困惑，不能早期施行準確及時的診治。而MTB-DNA擴增檢測具有敏感度和特異度均較高、可早期診斷MTB利福平耐藥等優點，卻無法有效檢出合并細菌或真菌的混合感染。相比實驗室細菌培養和MTB-DNA擴增檢測，mNGS是通過高通量測序和自動化生物信息分析進行檢測，可在短時間內將臨床樣本核酸序列與所有已知微生物基因組進行比對，從而精準診斷病原菌感染。作為應用于感染性疾病病原學診斷領域的新型檢測技術，mNGS應用于骨關節結核診斷的相關報道則較為少見。

mNGS檢測技術具有諸多優勢：(1)可明顯提升MTB的陽性檢出率，對關節結核具有更好的診斷效能；同時，還可以有效甄別除外關節的非結核感染性疾病。本研究細菌培養和MTB-DNA擴增檢測的敏感度分別為25.0%和50.0%，與國內學者的研究結果接近[6，8]，且陰性預測值分別為60.0%和69.2%；而mNGS的敏感度(93.8%)和陰性預測值(94.7%)均明顯高于以上兩種檢測方法；此外，MTB-DNA擴增檢測與臨床診斷一致性尚可(Kappa=0.515)，而mNGS與臨床診斷一致性良好(Kappa=0.942)，表明mNGS較MTB-DNA擴增檢測診斷效能更好。(2)檢測時間迅速。mNGS平均約需48 h即可得到檢測結果[9-10]，明顯短于傳統細菌和MTB培養鑒定的周期(分別為5 d和45～60 d)[11-12]。(3)能檢測出某些少見甚至罕見及不易培養的細菌。本研究中有1例膝關節感染患者經mNGS檢測確定為膿腫分枝桿菌，并在40 d后獲得手術病灶組織的非結核分枝桿菌培養陽性的證實，及時避免了被誤診誤治為關節結核的情況。國內有學者也曾報道了mNGS在非結核分枝桿菌骨關節感染的病原學精準診斷方面的優勢[13]。(4)可檢出復雜混合感染的多種病原體。本研究有4例合并竇道的關節結核患者是通過mNGS檢測明確了混合感染中的多種病原菌，對臨床診斷、治療、患者預后起到了關鍵作用。

本研究結果還顯示，與非結核感染性疾病組相比較，確診為關節結核患者經mNGS檢測出MTB的序列數據差異較大，變化范圍為5～7×104。其中有5例患者的序列數≤100，說明僅獲得了少量低于限值的MTB序列數，分析原因可能為：(1)關節結核病灶含菌量較低，MTB定植數是肺部的1/1000，從而導致病原體檢測陽性率低；(2)MTB屬于胞內細菌且細胞壁較厚，在提取處理病變組織樣本時因難以破壁，導致其胞外核酸釋放量較少；(3)非嚴格的低溫運輸條件，也可能加速核酸降解。有學者研究認為，當MTB為明確致病菌時，發生環境污染的可能性小，故mNGS只要檢測到1條屬水平的結核分枝桿菌復合群序列，在排除其他標本攜帶污染后即具有臨床意義[14]。因此，雖然在髖/膝關節感染性疾病的mNGS檢測報告中，MTB的序列數常低于化膿菌，甚至低于常規閾值，但仍認為有診斷與治療的臨床意義。

另外，mNGS檢測雖然對診斷關節感染性疾病具有諸多優勢，但還需注意到目前臨床應用中的諸多困惑：(1)1次檢測可匹配到細菌、病毒、支原體、真菌等多種微生物的序列，這在本研究結果中也有所體現，但應注意檢測結果會受到人源性細胞、定植和污染背景微生物的干擾，推薦在層流手術室采集關節感染病灶標本，并在采集后立即放置在無菌容器內以盡量縮短與空氣環境接觸的時間；(2)測序數據量和生物信息分析缺乏標準化，測序過程和結果仍缺乏質控標準[15-16]，且標本前處理操作繁雜，涉及多次轉管和移液操作，容易出現操作失誤和樣本污染；(3)檢測花費較高，外送檢測周轉時間較長，故建議mNGS適用于慢性反復發作、疑難復雜的骨關節感染患者。基于以上情況，筆者認為需根據檢測的微生物種類、序列數目，參考感染部位的背景微生物庫，結合患者的臨床特征和感染相關的實驗室結果來綜合判讀mNGS檢測報告：(1)檢出明確的致病菌，如MTB、曲霉菌等，因這類菌發生環境污染的概率較小，即使序列數較低，也要考慮可能為致病性病原體；(2)檢出易于引起局灶膿腫或軟組織感染的化膿菌，如葡萄球菌、鏈球菌、銅綠假單胞菌等，當其序列數較高且在報告檢出的病原體排名居第1～2位，可認為有臨床意義；(3)檢出非結核分枝桿菌，需要結合序列數、臨床及影像學表現、組織病理檢查，以及非結核分枝桿菌菌種培養鑒定和分子生物學診斷方法來進一步明確診斷。本研究受限于單中心、樣本量較少等，可能會影響結果的可靠性，未來有待進一步積累樣本量、聯合多中心開展深入研究。

綜上所述，mNGS可有效檢出髖/膝關節感染性疾病病原體，對關節結核具有更好的診斷效能，可提供重要的臨床指導。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻姚黎明：醞釀和設計實驗、采集/分析/解釋數據、起草文章；姚曉偉、董昭良和王連波：采集/分析/解釋數據；劉豐勝：醞釀和設計實驗、采集/分析/解釋數據；賈晨光：醞釀和設計實驗、分析/解釋數據、對文章的知識性內容作批評性審閱和指導