基于UHPLC-QTOF-MS/MS和分子對接篩選紫菀中潤腸通便的效應成分

吳 浩，黃蓓蓓，賈志鑫，劉 潔，陳奕君，肖紅斌*

1.北京中醫藥大學，北京 100029

2.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510006

隨著生物學和計算機科學等現代科學技術的發展，分子對接已成為藥物靶點和藥效成分篩選有力的工具，其原理就是利用計算機科學技術的相應的計算方法模擬分子的空間結構和分子間的相互作用力，通過研究分子間的空間作用力，尋找配體與受體活性位點的最佳結合方式的過程，在藥物的研發中發揮著越來越重要的作用[1-2]。同時，得益于超高效液相色譜串聯四極桿飛行時間質譜聯用技術（UHPLC-Q-TOF-MS/MS）的發展及其高分辨率、高靈敏度、高選擇性等優勢，可通過優化超高效液相色譜的色譜柱、流動相、洗脫條件等方式，結合四極桿飛行時間質譜中全面的數據采集方法及數據后處理分析策略，例如前體離子掃描，關鍵產物離子鑒別等，實現中藥單味藥、復方提取物及體內微量成分的準確高效全面的識別，為中藥（復方）成分及其代謝產物的分析及鑒定提供了有效的助力[3-4]。

紫菀為菊科（Compositae）多年生草本植物紫菀Aster tataricusL.f.的干燥根及根莖，別名青菀、返魂草、小辮等，生長于海拔400～2000 m 的山坡濕地、低山草地及沼澤地等；在我國分布十分廣泛，主產于山西、河北、東北、內蒙古東部等地區，也分布在朝鮮、日本等國。紫菀具有宣通肺氣、潤腸通便的功效，在臨床上常配伍薏苡仁、桔梗、杏仁、枳殼、葶藶子等使用治療術后便秘、腸癰等。現代藥理學研究表明，紫菀還具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化活性、化痰止咳平喘等作用[5-19]。前期研究發現紫菀潤腸通便的作用機制與細胞膜上的M 受體及鈣離子通道有關[20]，但是對于紫菀中發揮作用的確切效應成分尚不清楚，需要進一步深入的研究。因此，本研究將通過 UHPLC-Q-TOFMS/MS 技術分析給藥紫菀后的腸道內容物成分，針對與調節腸道的運動及平滑肌的收縮相關的M2、M3 受體蛋白和其下游信號通路中的蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）蛋白，采用分子對接技術篩選與受體蛋白結合性較好的中藥單體成分，進而闡明紫菀中潤腸通便的效應成分，為后期的深入研究以及新藥開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

本研究中使用的動物方案由北京中醫藥大學動物倫理審查委員會（批準號No.4-2018010103-10045）基于倫理程序和科學護理對其進行審核和批準。SD大鼠（180～220 g）購自北京維通利華動物科技有限公司。所有的動物均被飼養在恒溫（25±2）℃，相對濕度（50±10）%和12 h 光/暗周期的環境下。

乙腈，LC/MS 級，Fisher 公司；甲醇，LC/MS級，Fisher 公司；甲酸，LC/MS 級，Sigma 公司；去離子水，Milli-Q 水凈化系統自制；對照品均購自成都瑞芬思生物科技有限公司，色譜純，質量分數98%以上。

紫菀藥材購自北京同仁堂藥業有限公司，經北京中醫藥大學王學勇教授鑒定為紫菀A.tataricusL.f.的干燥根及根莖，藥材（CMAT-AT-201904）存放在北京中醫藥大學中醫藥研究院中藥分析與轉化研究中心。

1.2 樣品的制備

1.2.1 紫菀藥材提取液的制備 紫菀藥材200 g，料液比1∶10，50%的乙醇回流提取2 次，煮沸后，保持微沸1.5 h，用200 目濾布濾過，合并續濾液，用旋轉蒸發儀（溫度60 ℃、轉速45 r/min）旋蒸至無醇味，得質量濃度為0.8 g/mL（生藥量）的紫菀提取液。

1.2.2 腸道內容物供試品溶液的制備 SD 大鼠，3只，禁食18 h 后，ig 0.8 g/mL 的紫菀提取液，30 min后，水合氯醛麻醉，取出整段小腸，將腸內容物放入15 mL 離心管中，渦旋5 min 混勻，超聲處理15 min，高速離心15 min（12 000 r/min、4 ℃），取上清液；加入4 倍量乙腈沉蛋白，渦旋5 min 后，高速離心15 min（12 000 r/min、4 ℃），取上清液，過0.22 μm 微孔濾膜；用真空旋轉濃縮儀濃縮至干，50%的甲醇200 μL 復溶，渦旋5 min 后，高速離心15 min（12 000 r/min、4 ℃），取上清液，稀釋10倍檢測。

1.3 樣品分析

液相色譜條件：樣品的分離采用ACQUITY UPLC?HSS T3柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm，Waters公司），柱溫箱設定為30 ℃，檢測波長設定為220、254、275、315 和360 nm；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～1 min，5%B；1～5 min，5%～15% B；5～15 min，15%～30%B；15～23 min，30%～75% B；23～25 min，75%～95%B，，進樣體積為2 μL，體積流量為0.4 mL/min。

質譜條件：電噴霧離子源（ESI），正負離子模式檢測，詳細的質譜參數如表1所示。

表1 正、負離子模式下的質譜參數Table 1 Mass spectrum parameters in positive and negative ion modes

1.4 分子對接

1.4.1 小分子配體的準備 小分子配體是基于“1.3”項中鑒定的腸道內容物的化學成分，通過TCMSP、Chemspider、Pubchem 等網站查找并下載化合物的結構式，保存為mol 格式。然后利用Chemidraw 14.0軟件優化小分子配體的結構，采用MM2 力場進行能量最小化，保存為pdb 格式。

1.4.2 受體的準備 通過PDB 蛋白數據庫下載蛋白的三維結構圖，保存為pdb 格式，分辨率為0.3 nm，如圖1所示，為M2 受體、M3 受體和PKC 蛋白的三維結構圖。

圖1 靶標蛋白的三維結構圖Fig.1 Three-dimensional structure diagram of target protein

1.4.3 分子對接 運用SYBYL-X 2.0 軟件將處理過的小分子配體與蛋白進行對接，首先是設置文件保存路徑，接著導入對接的待測配體小分子，再導出待測配體小分子，選中所有的化合物，文件格式修改為SLN 格式，然后是處理靶標蛋白，提取靶標蛋白中與待測配體小分子相似的配體，同時移除配體外的其他配體及水分子，最后蛋白和待測配體小分子均處理完成后進行對接。

1.4.4 作圖分析 首先，運用SYBYL-X 2.0 軟件做圖分析，可以得到受體-配體三維結合模式圖及配體與氨基酸殘基形成的氫鍵作用力圖；然后，運用Discovery Studio 4.0 軟件進行相關做圖處理與分析，可以得到二維配體與氨基酸殘基形成的所有作用力圖；最后，分析圖中配體與氨基酸殘基結合作用力的大小。

2 結果

2.1 腸道內容物成分的鑒定

數據使用 Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis B.07.00 軟件處理系統進行分析，在一級和二級質譜圖中可獲得總離子總離子流圖（total ion chromatogram，TIC）、提取離子流圖（extracted ion chromatogram，EIC）、DAD 色譜圖、母離子及二級碎片離子等信息，并在此基礎上通過與文獻報道的紫菀藥材成分及對照品進行比對，在根據特征碎片離子（如肽類的關鍵產物離子m/z106.064 9，有機酸類的關鍵產物離子m/z191.055 6，黃酮類的關鍵產物離子m/z153.018 0）、保留時間和clogP值等輔助鑒定，進而推導并確認待核查化合物的名稱及結構[21]。利用上述分析方法，共鑒定出28 個化學成分，包括14 個肽類化合物，8 個有機酸類化合物，3 個黃酮類化合物和3 個香豆素類化合物（圖2 和表2）。圖3 為28 個化學成分的結構式。

圖3 大鼠ig 紫菀提取液后腸道內容物中化合物分子結構式Fig.3 Molecular structure formula of compounds in intestinal contents of rats after ig A.tataricus

表2 UHPLC-Q-TOF-MS/MS 鑒定的體內腸道內容物成分Table 2 Components of intestinal contents identified by UHPLC-Q-TOF-MS/MS

圖2 正、負離子模式下的提取離子流圖Fig.2 Extraction ion current diagram in positive and negative ion modes

2.2 分子對接結果

在本實驗中，配體和受體的結合穩定性主要是基于Total Score 打分函數，Total Score 函數考慮了極性作用、疏水作用、焓和溶劑化等因素，TotalScore打分值越高結合性越好[22]。根據文獻報道，本研究對接結果選擇Total Score 值大于5 的化合物作為候選的活性成分，進行分子作用力的分析。

2.2.1 M2 受體與配體小分子的分子對接結果 分子對接結果如表3所示，有11 個化合物表現出良好的結合活性，Total Score 值均大于5，其中異綠原酸C 的Total Score 值最高，為8.077 8，其次為astin J 和山柰酚。圖4 分別為異綠原酸C、astin J、山柰酚與M2 受體分子對接結合模式圖及與氨基酸殘基的相互作用圖。根據圖4 中3D 和2D 結合模式圖，進一步分析了這些化合物與蛋白質的作用關系發現，異綠原酸C 與M2 受體的10 個氨基酸形成范德華力，與13 個氨基酸形成靜電相互作用，并與108 號和404 天冬酰胺及426 號酪氨酸形成3 個氫鍵；山柰酚與M2 受體的4 個氨基酸形成范德華力，與12 個氨基酸形成靜電相互作用，與104 號和426號酪氨酸、404 號天冬酰胺、429 號半胱氨酸形成4個氫鍵。化合物異綠原酸C 與M2 受體的相互作用力總數比山柰酚多6 個，說明異綠原酸C 與M2 受體的結合性強于山柰酚，與表3 中打分值結果一致。

圖4 異綠原酸C、astin J 和山柰酚與M2 受體分子對接結合模式及與氨基酸殘基的相互作用Fig.4 Molecular docking binding pattern diagram and interaction diagram of amino acid residues of isochlorogenic acid C,astin J and kaempferol with M2 receptor

表3 配體與蛋白的分子對接整體打分值Table 3 Total score of ligand and protein with molecular docking

2.2.2 M3 受體與配體小分子的分子對接結果 如表3所示，與M3 受體分子對接的結果中Total Score大于5 的有13 個化合物，Total Score 值排名前3 的分別為asterin F、astin J 和異綠原酸B。圖5 分別為asterin F、astin J、異綠原酸B 與M3 受體分子對接結合模式圖及與氨基酸殘基的相互作用圖，從圖中可知，asterin F 與M3 受體的13 個氨基酸形成范德華力，與11 個氨基酸形成靜電相互作用，與148號酪氨酸、152 號天冬酰胺、238 號丙氨酸、503 號色氨酸和507 號天冬酰胺形成6 個氫鍵作用，并且與503 號色氨酸形成σ-π 超共軛和529 號酪氨酸形成π-π 共軛效應；異綠原酸B 與M3 受體的12 個氨基酸形成范德華力，與11 個氨基酸形成靜電相互作用，與222 號異亮氨酸、426 號天冬酰胺、506 號酪氨酸和532 號半胱氨酸形成4 個氫鍵，并且與506號酪氨酸形成π-π 共軛效應。化合物asterin F 和異綠原酸B 與M3 受體結合過程中都形成了共軛效應，asterin F 與M3 受體的相互作用力數總數大于異綠原酸B，因此，Total Score 值更大，結合力更強。

圖5 Asterin F、astin J 和異綠原酸B 與M3 受體分子對接結合模式及與氨基酸殘基的相互作用Fig.5 Molecular docking binding pattern diagram and interaction diagram of amino acid residues of asterin F,astin J and isochlorogenic acid B with M3 receptor

2.2.3 PKC 蛋白與配體小分子的分子對接結果如表3所示，與PKC 蛋白分子對接的結果中Total Score 值大于5 的有23 個化合物，Total Score 值排名前3 的分別為astin J、異綠原酸C 和astin E。根據圖6 可得，astin J 與PKC 的10 個氨基酸形成范德華力，與13 個氨基酸形成靜電相互作用，與253號精氨酸、256 號酪氨酸、257 號丙氨酸、289 號色氨酸、293 號谷氨酸、371 號賴氨酸和387 號天冬氨酸形成9 個氫鍵；Astin E 與PKC 的6 個氨基酸形成范德華力，與11 個氨基酸形成靜電相互作用，與氨基酸殘基形成7 個氫鍵。在與PKC 蛋白對接中發現，astin J、異綠原酸C 和astin E 與PKC 蛋白的氫鍵作用力較多，Total Score 打分值更高。

圖6 Astin J、異綠原酸C 和astin E 與PKC 蛋白分子對接結合模式及與氨基酸殘基的相互作用Fig.6 Molecular docking binding pattern diagram and interaction diagram of amino acid residues of astin J,isochlorogenic acid C and astin E with PKC protein

3 討論

便秘是一種常見的消化系統疾病，便秘的調節與分布在腸道上的神經遞質與其受體密切相關，腸道上分布有多種神經遞質，如Ach、NE、5-HT 等，這些神經遞質釋放后，通過突觸間隙，直接與其特異性受體結合發揮生理效應，進而調節腸道的運動和分泌[23-25]。目前認為，與Ach 結合的M 受體和Ca2+通道在便秘的發生中起主要的作用，M 受體分為M1、M2、M3、M4、M5 5 個亞型，但是研究發現M2 和M3 受體亞型在調節腸道的運動及平滑肌的收縮中起著更重要的作用[26]，同時，PKC 蛋白作為Ca2+通道調控機制的下游蛋白，其可被細胞質中的Ca2+激活，從而發揮調控腸道運動的作用[27]。前期研究也發現紫菀潤腸通便的作用機制與細胞膜上的M 受體及Ca2+通道相關[20]，但是對于紫菀中潤腸通便的效應物質尚不明確，因此，本研究采用M受體中與調節腸道的運動及平滑肌的收縮密切相關的M2、M3 受體亞型蛋白和Ca2+依賴性的PKC 蛋白作為靶標蛋白，通過分子對接技術與給藥紫菀后的腸道內容物成分進行對接，篩選出紫菀中潤腸通便的活性成分。結果表明，腸道內容物中含有28個紫菀中的化學成分，經分子對接篩選出astin J、asterin F、asterin A、異綠原酸C、異綠原酸A、異綠原酸B、綠原酸、槲皮素、山柰酚和木犀草素共10 個成分均可與M2 受體、M3 受體及PKC 蛋白體現出良好的分子對接活性，其中astin J 與3 種靶標蛋白的Total Score 值的平均值最高，且以上10 種活性成分與3 種靶蛋白的對接區域和內源性配體的結合位置基本相同。目前，已有文獻報道槲皮素通過調節M 受體及其下游信號PKC 蛋白的表達發揮治療洛哌丁胺所致的便秘[28]，在本研究篩選出的10個活性成分中，有7 個成分與3 種靶標蛋白結合的平均打分值強于槲皮素，這也保證了實驗結果的可靠性。因此，推測以上10 個潛在的化合物可能是治療便秘的最主要的活性成分，這也契合了中藥多成分、多靶點、多途徑的作用特點，但是對于這些成分確切的治療效果還需要進一步用細胞或動物實驗進行驗證。同時，本實驗為進一步研究紫菀通便的活性提供一定的理論依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突