基于miR-124-3p/IL-6信號通路的槲皮素和表兒茶素協同調節炎癥相關性結直腸癌研究

張 磊，羅 霄，劉明靚，陳葉梓，袁成福，何毓敏，劉朝奇，周永芹

三峽大學 基礎醫學院，湖北 宜昌 423000

結直腸癌是消化內科疾病中發病率最高的惡性腫瘤性疾病，近年來其發病年齡越來越趨于年輕化，且發病率逐年穩步上升，且發現晚[1]。慢性炎癥已被公認為多種癌癥的重要危險因素，癌變發生的各個階段都受到炎癥反應的影響，腸道炎癥是已知的結直腸癌危險因素，炎癥過程在結直腸癌的發展中起著重要的作用，且患有結腸炎的患者患上結腸癌的風險更高[2-4]。腸道組織中的細胞因子網絡是組織穩態和炎癥的關鍵介質，白細胞介素（interleukin，IL）在結直腸癌的發生機制中發揮中介作用[5]。炎癥相關性結直腸癌（colitis associated cancer，CAC）是與炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）相關的結直腸癌亞型，由長期反復的腸道炎癥所引起[6-7]。

氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）/葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）模型是一種可重復性高且相對便宜的CAC 動物模型。AOM 是一種致癌物，它可以通過細胞色素P450（cytochrome P450，CYP）以及同工酶CYP2E1 代謝，轉化為甲基苯丙醇，這是一種高活性的烷基化物種，可誘導DNA 產生O6-甲基鳥嘌呤化合物導致G→A 轉變[8]，在排入膽汁后，可被結腸上皮細胞所吸收并誘發DNA 損傷。DSS 是一種類似肝素的多糖，可對結腸上皮細胞造成損傷，并誘發結腸炎，從而模仿IBD的病理特征[9]。AOM/DSS 模型的主要特點是造模時間短和對CAC 的精確建模，腫瘤的發展可以在短至10 周內發生。此外，AOM/DSS 誘導的腫瘤組織病理學能很好地模擬人類CAC 的發生發展過程，如遠端腫瘤及浸潤性腺癌[10-13]。

近年的研究表明中醫藥干預結直腸癌具有一定的效果，也有越來越多的中草藥應用于結直腸癌的研究。槲皮素和表兒茶素為常見的類黃酮，二者具有結構相似性，存在多種中藥中，具有抗氧化、抗炎及抗腫瘤功效。文獻報道槲皮素和表兒茶素聯用有很好的協同抗氧化、抗炎等作用[14-17]。本研究旨在通過研究槲皮素和表兒茶素協同作用及機制，以期為臨床結直腸患者的用藥及治療提供新方向。

1 材料

1.1 動物

SPF 級C57BL/6 小鼠50 只，雌雄各半，體質量（20±2）g，購自三峽大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號SCXK（鄂）2017-0012，動物實驗倫理審核編號2019010T。動物分籠飼養，溫度及濕度適宜，光照條件正常，自由進食飲水，適應性飼養1 周。

1.2 藥品與試劑

槲皮素（批號 PCS-220201，質量分數為99.44%）、表兒茶素（批號PCS0077，質量分數為98.94%）購自成都植標化純生物技術有限公司；AOM（批號0218397180）、DSS（批號0216011090）購自廣州威佳科技有限公司；磷酸化信號轉導與轉錄活化因子3（phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3，p-STAT3）抗體（批號WLP2412）、IL-6 抗體（批號WL02841）購自沈陽萬類生物科技有限公司；β-actin（批號AC026）購自Abclonal 公司；羊抗鼠IgG 二抗（批號115-035-003）購自Jackson Immunoresearch；羊抗兔IgG 二抗（批號152203）購自武漢科瑞生物技術有限公司；Trizol、RT 逆轉錄試劑盒、SYBR 購自南京諾維贊生物科技有限公司；PCR 引物由上海生物工程（武漢）股份有限公司合成；RIPA 裂解緩沖液（批號G2002）、ECL 化學發光液（批號G2014-50ML）購自Servicebio 公司；蛋白定量試劑盒（批號G2026-200T）、蛋白上樣緩沖液購自Solarbio 公司（批號P1040）；PVDF 膜（批號R9SA26534）購自MilliPore 公司。

1.3 儀器

ChemiScope series 型全自動凝膠成像分析儀（上海歐翔科學儀器有限公司）；1658001 型垂直式蛋白電泳儀器、1703935 型蛋白轉印儀器（美國Bio-Rad公司）；Biometra TOne 96G 型PCR 儀（德國Analytik JenaAG 公司）；qTOWER3G 型qRT-PCR 儀（德國Analytik JenaAG 公司）。DYCP-31DN 型水平電泳槽（北京六一儀器廠）；CR21GII型高速離心機（日本日立公司）；TS100-F 型顯微鏡（日本Nikon 公司）。

2 方法

2.1 CAC 小鼠模型的建立、分組及給藥

50 只SPF 級C57BL/6 小鼠隨機分為對照組、模型組、槲皮素（35 mg/kg）組、表兒茶素（40 mg/kg）組和槲皮素（35 mg/kg）聯合表兒茶素（40 mg/kg）組，每組10 只。對照組ip 生理鹽水，其余各組小鼠ip AOM（12.5 mg/kg），給予普通飲食飲水5 d 后，給予2.5% DSS 飲用5 d，然后給予普通飲食飲水2周。接下來再重復2 次2.5% DSS 飲水，然后普通飲食飲水喂養至93 d。第1 輪2.5% DSS 飲用結束即第12 天，各給藥組開始ig 相應藥物，對照組ig等體積生理鹽水，直到整個周期結束。

2.2 結直腸形態學觀察

造模結束后，用頸椎脫臼法處死小鼠，解剖小鼠，先找到闌尾位置，根據盲腸位置取出全部結直腸組織，用生理鹽水清洗干凈腸腔的殘留物，縱形剖開部分結直腸，觀察腫瘤浸潤情況，將其放于白色背景下直尺旁拍照。

2.3 結直腸組織蘇木素-伊紅（HE）染色

取各組小鼠結直腸組織，于4%多聚甲醛中固定，脫水后包埋于石蠟中，切片，進行HE 染色，于顯微鏡下觀察組織病理變化。

2.4 結直腸組織總RNA 提取以及qRT-PCR 檢測

按照試劑盒說明書提取結直腸組織中總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR 分析。引物序列見表1，將U6作為miR-124-3P內參，將β-actin 作為Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）、IL-1β、IL-17、IL-6、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和c-myc內參。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2.5 Western blotting 檢測結直腸組織p-STAT3 和IL-6 蛋白表達

取各組小鼠結直腸組織，剪碎后，加入裂解液勻漿提取蛋白，采用BCA 法檢測蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液混勻后，100 ℃加熱10 min 使蛋白變性。蛋白樣品經12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF 膜，加入5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入p-STAT3 抗體（1∶1000）、IL-6 抗體（1∶1000）和β-actin 抗體（1∶10 000），4 ℃孵育過夜；次日用TBST 洗膜3 次，每次10 min，加入二抗（1∶8000），孵育1 h，用TBST 洗膜3 次，每次10 min，使用化學發光劑顯影進行曝光，以β-actin 作為內參，應用Image J 軟件分析條帶灰度值。

2.6 生物信息學預測

通過TargetScan 數據庫（https://www.targetscan.org/vert_72/）查找miR-124-3p的靶基因，預測miR-124-3p與靶基因IL-6的靶向調節關系[18]。

2.7 統計學分析

使用SPSS 22.0 和GraPhPad Prism 8.0 軟件進行統計學分析，每組數據均進行3 次獨立重復實驗，得到的計量資料以±s表示，采用單因素方差分析及獨立樣本t檢驗。

3 結果

3.1 槲皮素聯合表兒茶素對CAC 小鼠模型結直腸組織形態學的影響

如圖1-A所示，與對照組比較，模型組小鼠結直腸縱面可看出具有大量腫瘤浸潤；與模型組比較，單獨給藥組小鼠結腸縱形剖面腫瘤浸潤個數減少，聯合給藥組結腸無腫瘤浸潤。如圖1-B所示，與對照組比較，模型組腫瘤數量明顯升高（P＜0.001）；與模型組比較，各給藥組腫瘤數量均顯著減少（P＜0.01、0.001）。如圖1-C所示，各給藥組小鼠結直腸長度無統計學差異。

圖1 槲皮素聯合表兒茶素對CAC 小鼠模型結直腸組織形態(A)、腫瘤數量(B)和結腸長度(C)的影響(±s,n = 10)Fig.1 Effects of quercetin combined with epicatechin on colorectal tissue morphology(A),tumor number(B)and colon length(C)in CAC mice model(±s,n = 10)

3.2 槲皮素聯合表兒茶素對CAC 小鼠模型結直腸組織病理變化的影響

如圖2所示，對照組小鼠腸道黏膜平整，各層組織分界清楚，結構規則，黏膜隱窩結構中可見大量杯狀細胞；模型組小鼠結直腸組織結構不規則，沒有正常的結構分層，有大量異形細胞浸潤，細胞核變大，核深染，腺體結構不規則，杯狀細胞減少甚至消失，炎性細胞浸潤明顯；各給藥組結直腸異形細胞少量浸潤，炎性細胞較模型組少，腸黏膜結構不完整。

圖2 槲皮素聯合表兒茶素對CAC 小鼠模型結直腸組織病理變化的影響Fig.2 Effects of quercetin combined with epicatechin on pathological changes of colorectal tissue in CAC mice model

3.3 槲皮素聯合表兒茶素對CAC 小鼠模型結直腸組織炎癥相關基因表達的影響

如圖3所示，與對照組比較，模型組小鼠結直腸組織中TLR4、IL-1β、IL-17、IL-6的mRNA 表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，槲皮素組IL-1β和IL-17的mRNA 表達水平均顯著降低（P＜0.05、0.01），聯合給藥組和表兒茶素組TLR4、IL-1β、IL-17、IL-6的mRNA 表達水平均顯著降低（P＜0.05、0.01），且聯合給藥組較單獨給藥組作用更為顯著。

圖3 槲皮素聯合表兒茶素對CAC 小鼠模型結直腸組織TLR4、IL-1β、IL-6 和IL-17 mRNA 表達的影響(±s,n = 10)Fig.3 Effects of quercetin combined with epicatechin on TLR4,IL-1β,IL-6 and IL-17 mRNA expressions in colorectal tissue of CAC mice model(±s,n = 10)

3.4 槲皮素聯合表兒茶素對CAC 小鼠模型結直腸組織腫瘤相關基因表達的影響

如圖4所示，與對照組比較，模型組小鼠結直腸組織中VEGF和c-myc的mRNA 表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，槲皮素組、聯合給藥組和表兒茶素組c-myc的mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.05），聯合給藥組和表兒茶素組VEGF的mRNA 表達水平均顯著降低（P＜0.05），且聯合給藥組較單獨給藥組作用更為顯著。

圖4 槲皮素聯合表兒茶素對CAC 小鼠模型結直腸組織VEGF 和c-myc mRNA 表達的影響(±s,n = 10)Fig.4 Effects of quercetin combined with epicatechin on VEGF and c-myc mRNA expressions in colorectal tissue of CAC mice model(±s,n = 10)

3.5 槲皮素聯合表兒茶素對CAC 小鼠模型結直腸組織miR-124-3p/IL-6信號通路的調控作用

為了探究槲皮素和表兒茶素防治CAC 的協同作用是否與結腸組織中miR-124-3p表達相關，通過生物學信息預測miR-124-3p的靶基因，預測的結果提示miR-124-3p可以靶向IL-6的3’-UTR，靶向序列見圖5-A。采用qRT-PCR 檢測結直腸組織中miR-124-3p的表達，如圖5-B所示，與對照組比較，模型組miR-124-3p的表達明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組miR-124-3p的表達均明顯升高（P＜0.05）。采用Western blotting 檢測結直腸組織中IL-6 和p-STAT3 蛋白表達，如圖5-C所示，與對照組比較，模型組IL-6 和p-STAT3 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組IL-6蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05、0.01），聯合給藥組p-STAT3 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），且聯合給藥組較單獨給藥組作用更為顯著。

圖5 槲皮素聯合表兒茶素對CAC 小鼠模型結直腸組織中miR-124-3p/IL-6信號通路的調控作用Fig.5 Regulation of quercetin combined with epicatechin on miR-124-3p/IL-6 signaling pathway in colorectal tissue of CAC mice model

4 討論

IBD 與結直腸癌的發生發展密切相關，IBD 患者比正常人群高出2～3 倍的風險患結直腸癌，CAC是由長期腸道炎癥引起的一種常見結直腸癌，促炎因子和炎性細胞因子可促進其發生發展[19-20]。AOM是一種化學致癌物，AOM 和DSS 的聯合作用可誘導炎癥和結腸腫瘤的發生，本研究表明，腫瘤相關標志物VEGF、c-myc在AOM/DSS 誘導的CAC 模型小鼠結直腸組織中表達明顯升高，提示CAC 模型小鼠腸道已經發生了癌變，而單獨給藥組和聯合給藥組結直腸組織中腫瘤相關標志物表達較模型組顯著降低，且聯合給藥組腫瘤標志物降低程度明顯低于單獨給藥組。表明槲皮素和表兒茶素協同作用可以抑制結直腸腫瘤的形成。為了評估腸道炎癥反應在癌變過程中的作用，進一步檢測炎癥相關基因TLR4、IL-1β、IL-17的mRNA 表達水平，以明確槲皮素及表兒茶素的抗腫瘤作用是否與其抑制結直腸道炎癥相關。本研究結果顯示，與對照組比較，CAC模型小鼠腸道炎癥相關因子表達增加；與模型組比較，各給藥組炎癥因子表達明顯減少，且聯合給藥組炎癥因子低于單獨給藥組。表明槲皮素及表兒茶素可以抑制結直腸道的炎癥反應。

IL-6 在結直腸癌的腸上皮細胞中過度表達，在慢性炎癥發展為腫瘤疾病的過程中起著關鍵的作用，可通過作用于下游STAT3 途徑參與調控結直腸癌的增殖和轉移[21-23]。IL-6 能直接作用于腫瘤細胞，誘導下游STAT3 表達，進而促進腫瘤增殖或存活，STAT3 還可以誘導促進血管生成因子的表達，造成腫瘤侵襲、轉移以及免疫抑制[24-25]。miRNA 可以通過特異性mRNA 結合來沉默特異性mRNA，誘導翻譯抑制。研究表明，miRNA 在不同類型的癌癥中充當抑制腫瘤因子，具有成為癌癥的生物標志物以及化療靶標的潛在用途[26]。miR-124-3p被作為胃癌、肝細胞癌、膀胱癌等腫瘤發生進展的腫瘤抑制因子[27]。研究表明，miR-124-3p通過靶向IL-4Rα 緩解過敏性鼻炎中的炎癥反應[28]。本研究通過生物學信息學網站TargetScan 預測，IL-6為miR-124-3p的靶基因，同時通過檢測結腸組織中miR-124-3p、IL-6 和p-STAT3 的表達，發現與對照組比較，模型組IL-6、p-STAT3 蛋白表達水平明顯增加，miR-124-3pmRNA 表達水平明顯降低；與模型組比較，各給藥組IL-6、p-STAT3 蛋白表達水平明顯降低，miR-124-3pmRNA 表達水平明顯升高，且聯合給藥組較單獨給藥組作用更為顯著。提示槲皮素和表兒茶素協同作用可能通過上調miR-124-3p表達進而抑制結直腸組織中IL-6 和p-STAT3 的表達，抑制結直腸黏膜炎癥細胞浸潤，減少結直腸道炎癥反應，抑制CAC小鼠的疾病進程。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突