基于靶向NLRP3炎癥小體的金線蓮治療代謝相關脂肪性肝病活性成分發現及機制研究

沈廷明，顏于露，葉希奇，黃春情，吳軍軍，方 芝，王英豪，沈悰祺，吳荔芬

1.寧德市中醫院，福建 寧德 352100

2.福建中醫藥大學，福建 福州 350122

3.山西中醫藥大學，山西 太原 030024

4.莆田學院附屬醫院，福建 莆田 351100

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指在排除酒精和其他明確原因的情況下，由代謝紊亂誘發肝臟出現肝細胞內脂質過度沉積的一種慢性肝病[1]。脂質在肝臟中異常聚集會導致肝臟正常生理功能受損，嚴重的會導致肝臟纖維化、肝硬化、肝臟壞死。2020年專家組織在共識聲明中提議將非酒精性脂肪性肝病更名為代謝相關脂肪性肝病（metabolic-related fatty liver disease，MAFLD）[2]。MAFLD 全球患病率持續上升，對人類健康造成嚴重威脅。目前，西醫尚無治療MAFLD 的藥物，而中醫藥作為我國傳統醫學，在治療MAFLD 方面有獨特療效，顯現出巨大的優勢和開發應用前景。

金線蓮Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl 為蘭科開唇蘭屬的一種多年生草本植物，含有多種化學成分，包括黃酮類、多糖類、生物堿等[3]?，F代研究表明，金線蓮具有抗腫瘤、降血糖、保肝等藥理作用[4]。近年來，金線蓮及其提取物在治療MAFLD方面體現出一定的療效[5]。本研究運用網絡藥理學方法[6]探討金線蓮治療MAFLD 的作用機制，揭示金線蓮防治MAFLD 在靶點-通路層面的復雜分子機制，為金線蓮治療MAFLD 的作用機制探究提供新思路和新方向。

1 材料

1.1 動物

SPF 級C57BL/6 雌性小鼠，7～8 周齡，體質量（20±2）g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，動物合格證號NO.110324210105903262。動物飼養于溫度22～24 ℃、相對濕度（55±5）%、12 h 光暗循環的環境下，自由進食飲水。動物實驗倫理批準號IACUC-2021-0008。

1.2 藥品與試劑

槲皮素（批號HY-18085，質量分數為98.02%）、木犀草素（批號HY-N0162，質量分數為98.49%）、小鼠巨噬細胞集落刺激因子（批號HY-P7085）購自MedChemExpress 公司；DMEM 培養基（批號CM10013）購自中科邁晨；Opti-MEM 培養基（批號 31985-070）購自美國 Gibco 公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）購自Invivogen 公司；三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP，批號A2383）購自美國Sigma-Aldrich 公司；NOD 樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）抗體（批號15101S）、白細胞介素-1β 前體（interleukin-1β precursor，pro IL-1β）抗體（批號12242S）購自美國CST 公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1 前體（cystein-asparate protease-1 precursor，pro Caspase-1）抗體（批號AG-20B-0042）購自Adipogen 公司；凋亡斑點樣蛋白（apoptotic spot-like protein，ASC）抗體（批號sc-22514-R）購自Santa Cruz Biotechnology；IL-1β 抗體（批號12703S）購自R&D systems；Lamin B 抗體（批號66095-1-Ig）購自Proteintech 公司；驢抗小鼠二抗（批號115-035-003）、驢抗兔二抗（批號111-035-003）、驢抗羊二抗（批號705-035-003）購自Jackson Immuno Research。

1.3 儀器

3-18K 型離心機（美國Sigma 公司）；RX-N-C型顯影膠片（廣西巨星醫療器械有限公司）；JYJX5+型電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司）；HERAcell vios 160i 型培養箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

2 方法

2.1 金線蓮活性成分篩選

從PubChem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取金線蓮化學成分2D 結構及smile 式，進一步通過 SwissADME 數據庫（http://www.swissadme.ch/）篩選出其潛在的活性成分，通過SwissTargetPrediction 數據庫（http://www.swisstarget prediction.ch/）對潛在的作用靶點進行預測，結合UniProt數據庫（https://www.uniprot.org/）進行轉換。

2.2 MAFLD 疾病靶點篩選

以“metabolic associated fatty liver disease”為關鍵詞在Drugbank 數據庫（https://go.drugbank.com/）、TTD 數據庫（http://db.idrblab.net/ttd/）及Disgenet 數據庫（http://www.disgenet.org）中檢索得到疾病靶點，通過UniProt 數據庫（https://www.uniprot.org）進行轉換。

2.3 “活性成分-MAFLD”網絡的構建

利用Venny 圖得到金線蓮活性成分與MAFLD的交集靶點，導入Cytoscape 3.8.2 軟件構建“活性成分-MAFLD”網絡。

2.4 交集靶點蛋白質-蛋白質相互作用（proteinprotein interaction，PPI）網絡的構建

將交集靶點通過String 11.5 數據庫（https://cn.string-db.org/）構建物種為“Homo sapiens”的PPI，設定相互作用得分≥0.7，并隱藏掉游離靶點；將PPI結果從String 中導出并導入Cytoscape 3.8.0 軟件中進行可視化分析。

2.5 基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

通過David 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/），對交集靶點進行GO 功能和KEGG 通路富集分析，限定物種為“Homo sapiens”，其他參數默認[7]。當P＜0.05 被認為具有統計學意義。

2.6 細胞提取與培養

采用頸椎脫位法處死C57BL/6 雌性小鼠，用75%乙醇浸泡3～5 min，從小鼠骨髓中分離小鼠骨髓巨噬細胞BMDMs，用含有胎牛血清、青霉素-鏈霉素和50 ng/mL 小鼠巨噬細胞集落刺激因子的DMEM 培養基培養。細胞在37 ℃、5% CO2培養箱中培養5 d，第3 天補加DMEM 培養基和小鼠巨噬細胞集落刺激因子[8]。

2.7 細胞分組與給藥

2.7.1 核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路激活劑給藥處理 將BMDMs 以1×106個/mL接種于24 孔板中，500 μL/孔，培養過夜后，用含有不同濃度（10、20、40 μmol/L）槲皮素或木犀草素的Opti-MEM 培養基處理1 h，再給予50 ng/mL LPS 共同處理細胞3 h；另設置不含藥物的對照組和僅給予LPS 處理的模型組。

2.7.2 NLRP3 信號通路激活劑給藥處理 將BMDMs 以1×106個/mL 接種于24 孔板中，500 μL/孔，培養過夜后，用含50 ng/mL LPS 的DMEM 培養基處理細胞4 h，誘導炎癥小體前體組裝蛋白的表達；然后更換為含有不同濃度（10、20、40 μmol/L）木犀草素的Opti-MEM 培養基處理1 h，再給予5 mmol/L ATP 刺激1 h，誘導NLRP3 炎癥小體激活。另設置不含藥物的對照組和僅給予LPS處理的模型組。

2.8 Western blotting 檢測上清液中IL-1β 和細胞中NLRP3 炎癥小體相關蛋白表達

收集各組細胞和上清液，提取蛋白[9-10]，蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF 膜，加入5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入相應一抗，4 ℃孵育過夜；加入二抗孵育1 h，加入化學發光試劑顯影。

2.9 統計學分析

采用SPSS 21.0 軟件進行分析，定量數據用±s表示，對數據進行單因素方差分析或t檢驗。

3 結果

3.1 金線蓮的活性成分及對應靶點

共收集到金線蓮活性成分278 種，通過設定的ADME 條件篩選出潛在的活性成分166 種，去重后獲得活性成分的預測靶點557 個。

3.2 MAFLD 的疾病靶點

從Drugbank、TTD 數據庫分析得到14 個疾病靶點，從Disgenet 數據庫分析得到493 個疾病靶點，整合后共得到496 個疾病靶點。

3.3 “活性成分-MAFLD”網絡

將166 種活性成分的557 個靶點與MAFLD 的496 個疾病靶點取交集，得到103 個交集靶點（圖1）。通過Cytoscape 3.8.2 軟件可視化分析，構建“活性成分-MAFLD”網絡（圖2），主要成分包括槲皮素、木犀草素、異鼠李素、山柰酚等。

圖1 金線蓮活性成分與MAFLD 靶點的Venn 圖Fig.1 Venn diagram of active ingredient of A.roxburghii and MAFLD targets

圖2 “活性成分-MAFLD”網絡Fig.2 “Active ingredient-MAFLD” network

3.4 PPI 網絡分析

通過String 數據庫構建金線蓮活性成分與MAFLD 交集靶點的PPI網絡，如圖3所示，共有96 個節點、327 條邊，度值排名前10 位的靶點分別為熱休克蛋白90α（heat shock protein 90 alpha family class A member 1，HSP90AA1）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、蛋白激酶1（kinase protein 1，AKT1）、信號轉導與轉錄激活因子 3 （signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、雌激素受體α（estrogen receptor 1，ESR1）、過氧化物酶體增生激活受體γ（peroxisome proliferative activated receptor gamma，PPARG）、PPARA、MAPK8、Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）。

圖3 交集靶點的PPI 網絡Fig.3 PPI network of intersecting targets

3.5 GO 功能和KEGG 通路富集分析

GO 功能富集分析涉及細胞因子、細胞增殖和凋亡的調控、血管生成等163 個生物過程（biological process，BP），胞核、胞質等24 種細胞組分（cell component，CC），蛋白質結合、酶結合、轉錄因子結合等63 個分子功能（molecular function，MF）；KEGG 通路富集分析涉及炎癥通路、MAFLD、NLRP3 通路、NF-κB 通路等153 條通路。選擇-lgP最大的前10 名做圖，見圖4。

圖4 GO 功能(A)和KEGG 通路(B)富集分析(前10)Fig.4 GO function(A)and KEGG pathway(B)enrichment analysis(top 10)

3.6 槲皮素和木犀草素抑制NF-κB信號通路的激活

經典的NLRP3 炎癥小體組成蛋白NLRP3 和pro IL-1β 的表達受NF-κB 信號通路調控，NF-κB 參與了調控多種細胞焦亡和增殖相關因子的表達[11]。激活NF-κB 繼而促進NLRP3 和pro IL-1β、pro IL-18的轉錄，可為NLRP3炎癥小體的活化和發揮作用提供物質基礎[12]。為了驗證網絡藥理學方法篩選出的活性成分對NF-κB 信號通路的影響，采用Western blotting 檢測LPS 刺激的BMDMs 中NLRP3、pro Caspase-1、pro IL-1β 和ASC 蛋白表達，如圖5、6所示，槲皮素、木犀草素呈劑量相關性地抑制pro IL-1β的表達（P＜0.001），并對NLRP3 蛋白表達有輕微的抑制作用，表明槲皮素、木犀草素可以抑制NF-κB 信號通路的激活。

圖5 槲皮素和木犀草素抑制NF-κB 信號通路的激活Fig.5 Quercetin and luteolin inhibited the activation of NF-κB signaling pathway

3.7 木犀草素有效抑制NLRP3炎癥小體的激活

為了考察木犀草素對NLRP3 炎癥小體活化的影響，采用Western blotting 檢測LPS 及ATP 刺激的BMDMs 上清液中IL-1β 及細胞中NLRP3 炎癥小體相關蛋白表達，如圖7所示，木犀草素呈劑量相關性抑制BMDMs 上清液中成熟IL-1β 的分泌（P＜0.001），但對BMDMs 中NLRP3、pro Caspase-1、pro IL-1β 和ASC 蛋白表達沒有明顯影響。

圖7 木犀草素抑制NLRP3炎癥小體的激活(±s,n = 3)Fig.7 Luteolin inhibited activation of NLRP3 inflammasome(±s,n = 3)

圖6 槲皮素和木犀草素抑制pro IL-1β 蛋白表達(±s,n = 3)Fig.6 Quercetin and luteolin inhibited pro IL-1β protein expression(±s,n = 3)

4 討論

MAFLD 源自NAFLD，其發病機制尚不明確，關于MAFLD 的發病機制最經典的莫過于“二次打擊”學說[13]，認為其與通過多種途徑及損傷之間的相互作用有關，涉及胰島素抵抗、脂質代謝紊亂、氧化應激、炎癥浸潤、細胞凋亡等過程。其中，胰島素抵抗、脂質代謝紊亂為“首次打擊”[14]，導致肝細胞內脂質累積；“第二次打擊”為氧化應激介導的炎性反應，導致星形細胞激活造成肝細胞纖維化。細胞凋亡和炎性反應是MAFLD 發生肝纖維化、肝硬化的關鍵因素。NLRP3 炎癥小體在MAFLD、非酒精性脂肪性肝炎、腸炎、動脈粥樣硬化等多種炎性疾病中發揮了重要的作用，提示NLRP3 炎癥小體可以作為上述疾病診療的干預靶點[15-17]。

目前現代醫學的治療手段主要是改善胰島素抵抗和保肝抗炎，中藥治療通常以保肝抗炎為主[18-19]。研究顯示，金線蓮通過抑制脂質的過氧化、緩解血脂代謝紊亂、抗氧化應激、抗炎作用于MAFLD，與其發病機制契合。借助網絡藥理學的手段可有利地闡釋以金線蓮為例的藥物治療MAFLD 的核心成分及作用機制[20]。同時，通過細胞模型，借助Western blotting 驗證金線蓮靶向調控NLRP3炎癥小體的活性成分，對闡明金線蓮治療炎性疾病的物質基礎、作用機制、新藥開發和質量控制具有重要的作用。

4.1 金線蓮治療MAFLD 藥效成分發現

結合金線蓮“活性成分-MAFLD”網絡分析發現，金線蓮治療MAFLD 的主要活性成分是黃酮類，確認槲皮素、異鼠李素、木犀草素、山柰酚等166個活性成分，可以與103 個靶點相互作用，主要通過調節脂質代謝紊亂來降低肝細胞內脂質沉積從而達到治療MAFLD 的作用。張茂華等[21]發現槲皮素能改善胰島素抵抗，抑制脂質過氧化和影響炎癥因子水平，改善肝臟脂肪化的程度。周健等[22]發現異鼠李素可通過減輕氧化應激，緩解游離脂肪酸引起的脂質沉積，提高谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶活性。王新等[23]發現木犀草素能夠減少高脂飲食誘導的NAFLD 小鼠肝臟中脂質積累，并且能抑制小鼠肝臟內脂質合成的基因表達。由此可見，以槲皮素、異鼠李素、木犀草素、山柰酚為代表的活性成分在治療MAFLD 中發揮重要作用[24-25]。

4.2 金線蓮治療MAFLD 關鍵靶點預測

本研究基于網絡藥理學方法揭示了金線蓮可能介導關鍵靶點和信號通路起到治療MAFLD 的作用。PPI網絡分析顯示，金線蓮可能通過作用于HSP90AA1、STAT3、AKT1、EGFR、MAPK1、ESR1、PPARG、PPARA、MAPK8、JAK2 等主要靶點治療MAFLD。靶點預測結果顯示，HSP90AA1 可能為MAFLD 的關鍵靶點。SKP1 的G2 等位基因抑制因子（suppressor of G2 allele of SKP1，SGT1）、熱休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）和NOD樣受體（NOD-like receptors，NLRs）蛋白的關聯對于炎癥小體激活是不可或缺的[26]，因此靶向NLRP3炎癥小體或可作為上述疾病診療的干預靶點。

4.3 金線蓮治療MAFLD 作用機制研究

KEGG 通路富集分析發現，金線蓮治療MAFLD 主要涉及晚期糖基化終末產物（advanced glycation end product，AGE）-晚期糖基化終末產物受體（receptor for advanced glycation end product，RAGE）信號通路、缺氧誘導因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信號通路、脂質與動脈硬化、胰島素抵抗、酒精性肝病等通路，這些通路大多與MAFLD 疾病進程中的炎癥浸潤、脂質代謝紊亂和氧化應激反應有關，并參與MAFLD 的發生發展。排名前10 位的通路有3 項與癌癥通路相關，提示金線蓮在癌癥防治方面的臨床應用前景，另一方面對脂肪肝進一步發展為肝硬化、肝癌有一定防治作用。

4.4 靶向NLRP3炎癥小體的金線蓮活性成分治療MAFLD 的生物學驗證

綜上所述，金線蓮可能通過槲皮素、木犀草素、異鼠李素等多個活性成分，作用于HSP90AA1、STAT3、AKT1、EGFR、MAPK1、ESR1、PPARG、PPARA、MAPK8、JAK2 等103 個靶點，調控糖尿病并發癥AGE-RAGE 信號通路、HIF-1 信號通路等信號通路，參與調節脂質代謝紊亂、抑制氧化應激和炎癥反應等過程改善MAFLD 的肝損傷，發揮治療MAFLD 的作用。生物學驗證結果也進一步證實了金線蓮中的木犀草素、槲皮素不僅可以抑制NF-κB信號通路活化，而且還可以有效抑制NLRP3炎癥小體的激活。充分體現了中藥多組分、多靶點、多層次的整體調節作用，為進一步深入探討其作用機制奠定了基礎，為探索抗MAFLD 的藥效物質基礎和作用機制提供了方向，同時為金線蓮的安全性-有效性評價、質量控制、進一步開發及應用提供了科學依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突