激素性股骨頭壞死血管新生相關基因的鑒定及其靶向中藥成分篩選驗證

肖 振，李盛華

1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000

2.甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050

激素性股骨頭壞死（steroid induced osteonecrosis of femoral head，SONFH）是一種常見的進行性骨病，80%的患者會在1～4年內出現髖關節塌陷，最終需行人工關節置換，給社會家庭帶來沉重負擔[1]。SONFH的發生是由于免疫相關疾病過度使用糖皮質激素（glucocorticoid，GC）造成。GC 誘導的骨內皮細胞凋亡可激活血栓形成并減少血管生成[2]。骨內皮細胞包括骨微血管內皮細胞（bone microvascular endothelial cells，BMECs）和內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs），在維持血管穩態以及股骨頭血供中起著重要的作用。由骨內皮細胞受損引起的血管生成受損、細胞凋亡異常、血栓形成和脂肪栓塞被認為是SONFH 的關鍵發病機制[3-8]。研究發現，骨細胞不能在距離血管超過100 mm 處存活，所以學者們普遍認為血管發育總是先于成骨[9]。多項研究表明，血管內皮損傷與SONFH 密切相關，來自SONFH患者的BMECs 具有抑制遷移、血管生成受損和凋亡活性增加的特點[10-11]。另外，通過血管造影觀察血管化大轉子的骨移植治療股骨頭壞死能明顯改善股骨頭的血液灌注，并大幅改善患者髖關節活動功能[12]。因此，改善骨內皮細胞形態及功能是防控SONFH 發生和發展的重要調節因子。

血管生成是支持SONFH 修復的關鍵因素。研究發現使用普伐他汀和淫羊藿苷能促進血管新生，預防SONFH 的發生[13-14]。銀杏葉提取物能增加SONFH 模型小鼠血管內皮細胞的活性，抑制甲強龍誘導的內皮細胞凋亡和功能喪失，逆轉激素對磷酸化磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphorylated phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，p-PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）和磷酸化內皮型一氧化氮合酶（phosphorylated endothelial nitric oxide synthase，p-eNOS）表達水平的抑制，預防骨壞死[15]。本研究基于生物信息學分析篩選SONFH 中與血管生成相關的差異表達基因，進一步通過基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，確定SONFH 發病機制，以及核心基因的表達、功能、相互作用及信號通路，并進一步篩選靶向中藥活性成分，為靶向修復骨內皮細胞和探索SONFH 的治療靶點提供新思路。

1 材料與方法

1.1 SONFH 與血管新生相關的差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）的篩選

從GEO數據庫檢索“steroid induced osteonecrosis of the femoral head”或“SONFH”獲得GSE123568和GSE74089 數據集。GSE123568 包含10 個對照樣本和30 個SONFH 樣本，GSE74089 包含SONFH 和對照各4 個樣本。檢索Genecards 數據庫獲得SONFH靶基因2174 個。再通過檢索“endothelial cells”和“glucocorticoid”，獲得GSE25269 數據集，包含2 個對照組內皮細胞樣本和2 個地塞米松干預的細胞樣本。使用Prel 語言處理數據集，R 軟件的svg 包對數據集去批次處理，通過limma 包限定P＜0.05 獲得DEGs，制做熱圖進行可視化分析。

1.2 關鍵基因的篩選及GO 和KEGG 富集分析

將各數據集DEGs 導入venny2.1 軟件，獲得SONFH 中與血管新生相關的關鍵基因。進一步使用David 軟件獲取GO 富集和KEGG 通路相關信息。

1.3 關鍵基因的PPI 網絡構建與核心基因的篩選

通過STING 平臺和Cytoscape 3.9.0 軟件，深入了解SONFH 中差異表達血管新生相關基因的內在聯系。使用MCODE 插件對基因進行聚類分析，使用CytoHubb 插件獲取核心基因。

1.4 鑒定與SONFH 相關的核心基因

為了驗證核心基因篩選的可靠性，使用GSE123568 數據集鑒定選定的核心基因的表達水平。進一步使用CTD 數據庫驗證核心基因與SONFH 之間的相互作用關系。

1.5 靶向核心基因的中藥活性成分篩選

CTD 數據庫是比較毒理基因組學數據庫，采用CTD 數據庫搜索靶向作用于核心基因的中藥活性成分（限定interactions≥2）。

1.6 分子對接

在TCMSP 平臺、ZINC 數據庫搜索與核心基因作用指數最高的中藥活性成分的3D 結構（mol2 格式），在PDB 數據庫中輸入核心基因Uniprot ID，下載相關靶蛋白的pdb 格式文件，經PyMOL 去水加氫后，使用Autodock vina1.1.2 軟件進行分子對接，再用PyMOL 軟件將結果可視化。

1.7 體外實驗驗證

1.7.1 細胞及試劑 人BMECs 購自ICELL（上海）生物技術股份有限公司，白藜蘆醇（resveratrol）、3-MA（PI3K 抑制劑）購自MCE 上海皓元生物醫藥科技有限公司，注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉（methylprednisolone sodium，MPS，輝瑞制藥有限公司），實驗時將MPS 溶于ECM 培養基，3-MA 和白藜蘆醇分別溶于 DMSO，原液濃度均為 100 mmol/L，后續實驗使用內皮細胞培養基（endothelial cell medium，ECM）稀釋至合適濃度。0.1%胰蛋白酶-EDTA、細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）、RIPA 裂解液（北京索萊寶科技有限公司）；蛋白酶和磷酸酶抑制劑（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；Matrigel基質膠（BD Biosciences公司，美國）；Transwell 小室（24 孔培養板）、96 孔培養板（Corning 公司，美國）；血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）兔抗多克隆抗體（1∶1000）、PI3K 兔抗多克隆抗體（1∶1000）、Akt 兔抗多克隆抗體（1∶1000）、磷酸甘油醛脫氫酶（reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔抗多克隆抗體（1∶5000）；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記羊抗兔二抗（1∶5000）均為ImmunoWay 公司產品。

1.7.2 白藜蘆醇對MPS 干預后BMECs 增殖的影響使用ECM 培養制備BMECs 混懸液，細胞數2×105個/mL，加入96 孔板中，每孔100 μL，空白組不加細胞僅加100 μL ECM。過夜貼壁后，對照組加入ECM，處理組分別用終濃度25、50、75、100、200 μmol/L 白藜蘆醇＋20 μg/mL（終質量濃度）MPS[16]處理24、42、72 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 避光孵育2 h。酶標儀（BioRed，美國）檢測450 nm 處的吸光度（A），計算細胞活力。實驗重復3 次。

細胞存活率＝(A處理－A空白)/(A對照－A空白)

1.7.3 白藜蘆醇對MPS 干預后BMECs 遷移的影響

（1）劃痕實驗：將細胞以2×105個/孔接種于6孔板內，分為6 組：對照組、模型（10 mg/mL MPS）組、3-MA 抑制劑（10 mg/mL MPS＋5 mmol/L[16]3-MA＋100 μmol/L 白藜蘆醇）組及白藜蘆醇低、中、高劑量（10 mg/mL MPS＋50、100、200 μmol/L白藜蘆醇）組。細胞在無血清培養基中饑餓8 h 后，用200 μL 移液管吸頭刮去內皮細胞，洗滌未附著的細胞，每組給予相應藥物，培養0、24 h 后拍照，計算劃痕愈合率。實驗重復3 次。

劃痕愈合率＝(0 h 劃痕寬度－24 h 劃痕寬度)/0 h 劃痕寬度

（2）Transwell 遷移實驗：分組和給藥同劃痕實驗，消化細胞并用PBS 洗滌3 次去除血清影響，用無血清培養基調整細胞密度為1×105個/mL，每孔加入200 μL 細胞懸液于Transwell 小室內，24 孔板內加入750 μL 含10% FBS 的ECM 培養基。每組給予相應藥物，孵育24 h 后，Transwell 小室用甲醇固定，0.1%結晶紫染色；隨后用棉簽去除每個小室內部未遷移細胞，倒置顯微鏡下觀察。隨機取3 個視野計數遷移細胞并取均值，實驗重復3 次。

1.7.4 蛋白質印記分析 分組和給藥同劃痕實驗，BMECs 給予相應處理48 h 后，通過RIPA 裂解緩沖液（含蛋白酶和磷酸酶抑制劑1∶100）提取蛋白質，紫外分光光度計測定蛋白濃度并稀釋濃度至10 mg/mL。加入5×上樣緩沖液混合均勻，在95 ℃下加熱5 min 導致蛋白質變性。使用8% SDS-PAGE 分離膠分離40 μg 蛋白質樣品，然后將其轉移到PVDF膜上，用10%脫脂牛奶封閉2 h，然后一抗在隨后的4 ℃下孵育過夜。之后，與其相應的二抗進行孵育。用電化學發光法觀察條帶。Image Lab 3.0 軟件用于量化條帶灰度值。實驗重復3 次。

1.8 統計學處理

使用GraphPad Prism 9.0.0 統計分析，實驗數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SONFH 與血管新生的DEGs 的確定

數據集和平臺信息見表1，通過GEO2R 獲得差異表達基因，以P＜0.05 為條件篩選DEGs，GSE123568 包含12 796 個，GSE74089 包含12 120個，Genecards 包括2354 個，其中GSE123568 和GSE74089 的數據經Perl 語言處理合并及R 軟件（svg 包）矯正后，使用ggplot2 包將數據可視化，見圖1，SONFH 差異基因火山圖及熱圖見圖2。綜合各數據集共獲得SONFH 的DEGs 963 個，見圖3-A。同樣篩選GSE25269（P＜0.05）數據集獲得與血管生成相關的2373 個DEGs，前50 個DEGs 熱圖見圖3-B。

圖2 SONFH 的DEGs 火山圖和聚類熱圖Fig.2 Volcano map(A)and clustering heat map(B)of DEGs of SONFH

表1 數據集基本信息Table 1 Basic information of data set

圖1 GEO 數據矯正Fig.1 GEO data correction

2.2 關鍵基因的篩選

將SONFH 中與血管生成相關的基因定義為關鍵基因。將各數據集DEGs（P＜0.05）導入venny 2.1 軟件，獲得118 個SONFH 中與血管新生相關的DEGs（圖3-C）。其中74 個在SONFH 中表達上調，44 個在SONFH 中表達下調。

圖3 SONFH 和血管新生相關的DEGs 及關鍵基因的篩選Fig.3 SONFH and angiogenesis related DEGs and screening of key genes

2.3 關鍵基因GO 和KEGG 富集分析

使用DAVID 數據庫進行關鍵基因的GO 富集（圖4-A、B、D）和KEGG 通路富集分析，GO富集中生物過程主要涉及正調控血管生成、細胞黏附、炎癥、細胞增殖、遷移和傷口愈合等；細胞組分主要涉及細胞外間隙、細胞外基質和胞外區；分子功能涉及蛋白質結合、血小板衍生生長因子和蛋白酶結合等。KEGG 主要富集到PI3K 信號通路、黏附斑信號通路、細胞外基質受體互作通路和Ras 相關蛋白1（Ras-related protein 1，Rap1）信號通路等，關鍵基因與通路的桑基氣泡圖見圖4-C。

圖4 關鍵基因的GO 和KEGG 富集分析Fig.4 GO and KEGG enrichment analysis of key genes

2.4 關鍵基因蛋白質相互作用網絡（proteinprotein interaction network，PPI）及核心基因篩選

將DEGs 導入STRING 平臺，隱藏無連接的節點，獲得包含102 個節點和443 條邊的PPI網絡，再導入Cytoscape，使用NetworkAnalyzer 工具計算節點屬性，節點大小對應度（degree）大小，見圖5。再使用Cytoscape 的MCODE 插件尋找關鍵的子網絡6 個，見圖6-A～F，其主要子網絡（圖6-A）涉及vegf 激活的血小板衍生生長因子受體信號通路對細胞增殖、一氧化氮介導的信號轉導調節、冠狀血管形態發生和細胞黏附的正調節。

圖5 關鍵基因PPI 網絡(節點大小對應度值大小)Fig.5 PPI network of key genes(node size correspondence degree value size)

通過Cytoscape 軟件中的CytoHubba 插件篩選關鍵基因中最大中心度（maximal clique centrality，MCC）評分前10 位的基因，定義為核心基因。通過篩選依次為血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGFA）、白蛋白（albumin，ALB）、胰島素（insulin，INS）、胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1，IGF1）、透明質酸的受體（CD44）、整合素β-1（integrin beta-1，ITGB1）、Thy-1 膜糖蛋白（Thy-1 membrane glycoprotein，THY1）、血小板衍生生長因子受體β（platelet-derived growth factor receptor beta，PDGFRB）、受體型酪氨酸蛋白磷酸酶 C（receptor-type tyrosine-protein phosphatase C，PTPRC）和膠原蛋白α-1（collagen alpha-1(I)chain，COL1A1），見圖6-G。進一步對核心基因富集通路分析，結果顯示通路主要富集到PI3K-Akt、黏附斑、Ras 和Rap1 信號通路等（圖7），與關鍵基因富集通路大致相同。

圖6 PPI 網絡基因簇模塊(A～F)與核心基因(G)Fig.6 Gene cluster module of PPI network(A—F)and core genes(G)

圖7 核心基因富集通路圖Fig.7 Enrichment pathway map of core genes

2.5 SONFH 血管新生相關的核心基因的篩選及鑒定

通過驗證GSE123568 數據集鑒定選定的10 個核心基因的表達水平，發現核心基因表達均差異明顯（P＜0.05，圖8-A），尤其PTPRC、CD44、IGF1和VEGFA的差異最為顯著，其中CD44、ITGB1和PTPRC表達上調，其余皆表達下調。進一步受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）分析顯示PTPRC、CD44、IGF1、PDGFRB、ITGB1和VEGFA的曲線下面積（area under curve，AUC）值分別為0.897、0.837、0.777、0.770、0.767 和0.703（圖8-B）。

圖8 核心基因在SONFH 中的表達情況Fig.8 Expression of core genes in SONFH

再使用CTD 數據庫驗證核心基因與SONFH 之間的相互作用關系（圖9），結果發現COL1A1、IGF1、VEGFA和PTPRC與SONFH 作用指數較高，提示可能為干預修復SONFH 的重要靶點。

圖9 核心基因與SONFH 相互作用指數Fig.9 Interaction index of core genes and SONFH

2.6 靶向核心基因的中藥活性成分篩選

CTD 數據庫中靶向作用于核心基因的中藥活性成分（interactions≥2）見表2。結果顯示白藜蘆醇、姜黃素、雌二醇和槲皮素等與核心基因相互作用指數較高，提示這些活性成分可能是作用核心基因促進血管新生修復SONFH 關鍵藥物成分。

表2 靶向作用核心基因的中藥活性成分Table 2 Active components of traditional Chinese medicine targeting core genes

2.7 分子對接

通過Autodock vina 軟件分子對接，顯示靶向核心基因的主要中藥活性成分白藜蘆醇與VEGFA、PTPRC、ITGB1、PDGFRB、IGF1和CD44結合能均小于-5 kcal/mol（1 kcal＝4.2 kJ），結合穩定，結合能依次為-6.2、-6.1、-5.9、-5.6、-5.2 和-5.3 kcal/mol。白藜蘆醇與各蛋白形成氫鍵豐富，結構構象穩定，如與VEGFA通過氨基酸殘基SER-9、GLY-42、GLY-41、LYS-103 形成4 個氫鍵；與PTPRC通過氨基酸殘基SER-828/SER-829、ARG-834、GLY-833、HIS-797、GLN-872 形成6 個氫鍵；與PDGFRB通過氨基酸殘基SER-40、SER-39、SER-77、ARG-19、ARG-37、PTR-1 形成6 個氫鍵；與ITGB1通過殘基ARG-309、THR-310、SER-233 形成3 個氫鍵；與IGF1通過氨基酸殘基GLY-19、GLN-15 形成2個氫鍵；與CD44通過氨基酸殘基SER-109、ILE-26、GLU-37 形成3 個氫鍵（圖10），結果提示白藜蘆醇有可能通過核心基因VEGFA、PTPRC、ITGB1、PDGFRB、IGF1 和CD44發揮修復SONFH 的作用。

圖10 白藜蘆醇與核心基因結合位點Fig.10 Sites of resveratrol binding to core gene

2.8 白藜蘆醇對MPS 干預后BMECs 的影響

2.8.1 對BMECs 增殖的影響 CCK8 檢測顯示，白藜蘆醇濃度為100 μmol/L 且作用48 h，能顯著改善MPS 對BMECs 活性的抑制，見圖11。

圖11 白藜蘆醇對MPS 干預后BMECs 活力的影響(n＝3)Fig.11 Effect of resveratrol on BMECs activity after MPS intervention(n = 3)

2.8.2 對 BMECs 遷移的影響 劃痕實驗和Transwell 實驗結果（圖12）表明，基于劃痕愈合率和細胞遷移數量兩方面，模型組BMECs 的遷移顯著低于對照組（P＜0.05），白藜蘆醇低、中、高劑量組BMECs 的遷移明顯高于模型組，白藜蘆醇中劑量組明顯高于3-MA 抑制劑組（P＜0.05）。

圖12 白藜蘆醇對細胞遷移的影響(±s,n=3)Fig.12 Effects of resveratrol on cell migration(±s,n=3)

2.8.3 對細胞蛋白表達的影響 Western blotting 檢測結果（圖13）顯示，與對照組比較，模型組PI3K/Akt/VEGF 通路蛋白表達降低，其中PI3K 表達水平降低顯著（P＜0.05）；與模型組比較，白藜蘆醇低、中、高劑量組中Akt、VEGF 蛋白相對表達量均明顯升高（P＜0.05），白藜蘆醇中、高劑量組PI3K 蛋白相對表達量明顯升高（P＜0.05），而3-MA抑制劑組較白藜蘆醇中劑量組通路蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。

圖13 白藜蘆醇對MPS 誘導降低的BMEC 中PI3K/Akt/VEGF 信號通路蛋白表達的影響(±s,n=3)Fig.13 Effects of resveratrol on PI3K/Akt/VEGF signaling pathway protein expression in MPS induced BMECs(±s,n=3)

3 討論

SONFH 是難治性骨科疾病，主要由血液供應中斷和凝血系統功能障礙引起，導致骨細胞死亡、股骨頭塌陷。GC 的使用抑制了血管生成、骨修復和一氧化氮的代謝，通過調節血管活性介質如內皮素-1、去甲腎上腺素和緩激肽來誘導骨內股骨頭動脈血管的收縮導致股骨頭缺血，以及增加骨內壓引起缺血，促進內皮細胞的凋亡，減少流向股骨頭的血量[17-20]。骨內皮細胞不僅可以形成微血管系統，為發育中的骨骼提供營養，還可以在體外和體內增強間充質干細胞的成骨分化，促進骨修復。因此，尋找SONFH 中與血管生成相關的基因，在診斷和修復SONFH 方面具有重要作用。

本研究分析了公共數據庫中可用的微陣列數據集GSE123568、GSE74089、GSE25269 和Genecards數據庫，獲得SONFH 的DEGs 共963 個，血管生成相關DEGs 共2373 個，獲得SONFH 中與血管生成相關的關鍵基因118 個，其中74 個在SONFH 中表達上調，44 個在SONFH 中表達下調。這些基因主要富集于正調控血管生成、細胞黏附、炎癥、細胞增殖和遷移、傷口愈合等，大部分作用于細胞質和核質。有研究證實細胞因子IL-10 和TNF-α 與SONFH 的發生有關[21]。據報道，促紅細胞生成素通過刺激VEGF 的表達來促進血管生成，以保護股骨頭免受GC 誘導的骨壞死的侵害[22-23]。細胞黏附相關蛋白Rap1 在SONFH 中下調，對股骨頭內微血管內皮細胞黏附及遷移造成障礙，未能對受損血管內皮及時修復，加速骨壞死進程[24]。此外，KEGG 富集分析主要涉及PI3K-Akt 信號通路、黏著斑信號通路、細胞外基質受體互作通路和Rap1 信號通路等。參與這些途徑的大多數基因都被上調了。PI3K-Akt是一個重要而復雜的信號通路，其在干細胞調節的細胞存活、增殖、遷移和血管生成中起著核心作用。激活PI3K-Akt 信號通路可顯著增強各種組織中內皮細胞的功能[25]。黏著斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）是一種非受體蛋白酪氨酸激酶和支架蛋白，可介導許多細胞功能，包括黏附、遷移和侵襲。FAK 抑制劑可減少滑膜成纖維細胞的侵襲和遷移，因此，抑制FAK 可能有助于改善在SONFH 發展中的骨髓水腫和滑膜炎[26]。黏著斑與細胞生長、形狀和運動有關。研究表明，黏著斑是股骨頭壞死后未成熟關節軟骨中顯著豐富的生物學途徑[27]。本團隊前期研究發現非創傷性股骨頭壞死可能與信號通路Rap1/PI3K/Akt 受到抑制導致其表達下降所引起的血管內皮損傷有關[24]。細胞外基質受體互作通路與血管生成、軟骨生成和軟骨退化有關[28]，且在股骨頭壞死的髖軟骨中顯著富集[29]。本研究結果提示PI3K-Akt 信號通路、黏著斑和Rap1 信號通路等參與了SONFH 的發病機制。

10 個核心基因是VEGFA、ALB、INS、IGF1、CD44、ITGB1、THY1、PDGFRB、PTPRC和COL1A1。這些核心基因都可能在SONFH 發生和發展中起到重要作用。VEGFA基因位于染色體6p31.3[30]，是編碼血管內皮生長因子的成員，與VEGF 受體在胞外結合，刺激細胞內酪氨酸激酶，促進內皮細胞增殖，增加血管通透性。已有研究將VEGFA 啟動子區域內的多個遺傳多態性與非創傷性SONFH 的疾病狀態聯系起來。VEGFA 是血管生成的關鍵介質[31]，誘導內皮細胞增殖，促進細胞遷移，抑制細胞凋亡并誘導血管通透。使用VEGF受體拮抗劑可以在動物模型中阻斷血管生成并誘導SONFH[32]。IGF1 調控細胞生長、分化，如刺激成骨細胞和內皮細胞的增殖，促進組織再生與修復。IGF1 可逆轉地塞米松對PI3K-Akt 信號通路的抑制，并抑制其下游叉頭框蛋白O1（forkhead box protein O1，FOXO1）的表達，進而治療SONFH[33]。CD44 抗原是透明質酸（hyaluronic acid，HA）的受體。通過其與HA 和其他配體（如骨橋蛋白、膠原蛋白和基質金屬蛋白酶）的親和力來介導細胞與細胞、細胞與基質的相互作用，其與HA 的結合在細胞遷移中起作用。PDGFRB 通過促進周細胞和平滑肌細胞向內皮細胞的增殖、遷移和募集，在血管發育中起至關重要的作用[34]。PTPRC 是抗原受體激活T 細胞所需的蛋白質酪氨酸-蛋白質磷酸酶。有研究發現微重力環境中的小鼠股骨頭出現了骨吸收，檢測髓腔分離的細胞顯示早期間充質干細胞造血分化的基因 PTPRC 的表達顯著下調[35-36]。COL1A1 在SONFH 模型兔中的表達被抑制，使用葛根素后COL1A1 的表達升高，且SONFH 模型兔的成骨能力增加[37]。目前ALB、INS、CD44和THY1等核心基因在骨壞死中的作用機制尚不清楚，有待于進一步研究。

通過GSE123568 數據集鑒定，發現核心基因尤其是PTPRC、CD44、IGF1和VEGFA的表達差異最為顯著。ROC 分析顯示PTPRC、CD44、IGF1、PDGFRB、ITGB1和VEGFA的AUC 值均大于0.7，具有較大可能性成為SONFH 潛在生物標志物，Ma等[38]在1 項漢族人群VEGFA與SONFH 的遺傳關系的研究中，VEGFA單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNP）基因型rs2010963與SONFH 顯著相關。通過CTD 數據庫驗證核心基因與SONFH 之間的相互作用關系，發現COL1A1、IGF1、VEGFA和PTPRC與SONFH 作用指數較高，提示可能為干預修復SONFH 的重要靶點。目前已有通過VEGFA 防治SONFH 的研究，有研究發現促紅細胞生成素通過刺激VEGFA 的表達，可保護股骨頭免受GC 誘導的骨壞死的侵害[39]。CTD 數據庫篩選靶向核心基因的中藥活性成分，發現白藜蘆醇、姜黃素、雌二醇和槲皮素等與核心基因相互作用指數相對較高，為防治SONFH 提供了新的方向。

分子對接顯示白藜蘆醇與SONFH 中與血管新生有關的核心基因結合穩定，并通過體外細胞實驗證實白藜蘆醇能顯著上調本研究篩選的核心基因VEGFA及PI3K/Akt 信號通路的表達水平，表明白藜蘆醇對激素干預的BMECs的損傷具有修復作用，主要通過激活 PI3K/AKT/VEGF 信號通路提高BMECs 的活性并促進細胞的遷移。也有研究發現，白藜蘆醇可以改善SOFNH 兔模型中的骨骼血液供應，以保護血管內皮細胞并減少血栓形成[40-41]。研究表明，姜黃素可通過抑制Janus 激酶1/2（Janus kinase 1/2，JAK1/2）-信號轉導和轉錄激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）途徑抑制SONFH 模型小鼠細胞M1 極化來防止炎癥介導的骨細胞凋亡[42]，與本研究篩選結果一致，說明姜黃素有很大潛能成為臨床治療SONFH 藥物的新選擇。

4 結論

通過生物信息學分析鑒定了SONFH 血管新生相關的核心基因和通路，尤其是PTPRC、IGF1、VEGFA、ITGB1、PDGFRB和CD44核心基因和PI3K信號通路、黏附斑信號通路、細胞外基質受體互作通路和Rap1 信號通路等，它們可能與SONFH 發病密切相關；篩選出白藜蘆醇最有可能成為預防或逆轉骨壞死的潛在藥物，并進行了實驗驗證。本研究有助于理解血管新生在SONFH 發病機制中的作用，為尋找具有SONFH 診斷或治療價值的生物標志物的相關大樣本研究提供參考依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突