HPLC測定壯藥羊開口中3,3′,4′-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量

劉立輝，黃麗玲，唐林波，常 華，鄒 洵

桂林三金藥業(yè)股份有限公司，廣西 桂林 541004

羊開口Radix Melastomatis normalis，壯藥名為棵芒難，為野牡丹科（Melastomaceae）野牡丹屬MelastomaL.植物展毛野牡丹Melastoma normaleD.Don 的干燥根，為廣西壯族地區(qū)習(xí)用藥材，收載于《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（第一卷）》，味甘、酸、澀，微溫，具有收斂、止血、解毒的功效，用于泄痢、崩漏帶下、內(nèi)外傷出血[1]。羊開口是中成藥三金片系列產(chǎn)品的重要原料之一，但現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并沒有關(guān)于羊開口的含量測定項，僅有少量文獻(xiàn)報道測定羊開口中沒食子酸和鞣花酸的含量研究[2-3]。

本課題組前期對羊開口進(jìn)行了化學(xué)成分研究，發(fā)現(xiàn)3,3?,4?-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷為羊開口的特征性成分之一[4]。此外，文獻(xiàn)報道此類成分具有良好的抗腫瘤、抗氧化、抗菌和抗病毒等藥理活性，且該類成分的化學(xué)性質(zhì)相對比較穩(wěn)定[5-6]。因此，選擇3,3?,4?-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷作為羊開口的含量測定指標(biāo)成分。鑒于現(xiàn)有羊開口的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較簡單，缺少含量測定項，本實驗對羊開口的特征性成分之一的3,3?,4?-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷進(jìn)行HPLC 含量測定研究，以期為羊開口質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695 高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；2996 PDA 檢測器（美國Waters 公司）；Empower 2 色譜工作站；BRANSON BUG 40-60 超聲波清洗儀（上海必能信公司，功率250 W，頻率40 kHz）；XP 205 型電子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司，d=0.01 mg）；GF-200 型電子天平（日本AND公司，d=0.001 g）；MILLI-Q 型密理博超純水儀（德國Merck 公司）；DZF-6500 型真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥

3,3?,4?-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品為本課題組自制，通過解析其MS、1H-NMR、13C-NMR 數(shù)據(jù)，并參照文獻(xiàn)報道[7]確定結(jié)構(gòu)，HPLC峰面積歸一化法計算其質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于99.0%。乙腈、甲醇為色譜純（德國Merck 公司），高效液相用水為超純水，其余試劑均為分析純。

15 批羊開口藥材分別采自廣西各地，經(jīng)中國科學(xué)院廣西植物研究所蔣水元研究員鑒定均為野牡丹科植物展毛野牡丹M.normaleD.Don 的干燥根，具體產(chǎn)地見表1。

表1 羊開口產(chǎn)地信息Table 1 Origin information of Radix Melastomatis normalis

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

取干燥至恒定質(zhì)量的3,3?,4?-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品適量，精密稱定，加二甲基亞砜溶解制成含0.02 mg/mL 3,3?,4?-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備

取本品粉末（過80 目篩）約2.0 g，精密稱定，置100 mL 具塞錐形瓶中，精密加入80%丙酮25 mL，稱定質(zhì)量，密塞，超聲提取（功率250 W，頻率40 kHz）60 min，放冷至室溫，再稱定質(zhì)量，用80%丙酮補足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，吸取上清液，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件

Welch Materials Ultimate AQ C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相A 相為乙腈，B相為0.2%磷酸水溶液，梯度洗脫程序：0～50 min，90%～70% B；50～51 min，70%～90% B。體積流量為1.0 mL/min，檢測波長為246 nm，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。在此條件下，理論塔板數(shù)按3,3?,4?-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷峰計算不得低于80 000，3,3?,4?-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷色譜峰與相鄰的其他色譜峰的分離度應(yīng)大于1.5。色譜圖見圖1。

圖1 二甲基亞砜空白溶劑(A)、3,3′,4′-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品(B)和供試品(C)的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of dimethyl sulfoxide blank solvent(A),4-O-β-D-glucopyranosyl-3,3′,4′-tri-O-methylell agic acid(B)and test substance(C)

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取 3,3?,4?-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品溶液1、2、5、10、15、20 和30 μL 注入液相色譜儀，按“2.3”項下色譜條件測定并記錄相應(yīng)色譜峰面積，以對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝6.0×106X－1.910 5×104，r＝1.000 0。結(jié)果表明，3,3?,4?-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷在0.02～0.60 μg 內(nèi)其進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗

取同一批羊開口樣品粉末（8 號樣品）約2.0 g，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次測定，計算得到3,3?,4?-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 為1.72%。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一批羊開口樣品粉末（8 號樣品）約2.0 g，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于配制后0、1、2、4、8、24 h 按“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算得到3,3?,4?-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 為2.53%。

2.7 重復(fù)性試驗

取同一批羊開口樣品粉末（8 號樣品）約2.0 g，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，平行制備6 份，分別按“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算得到3,3?,4?-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 為1.00%。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的同一批羊開口樣品粉末（8 號樣品）約1.0 g，平行6 份，精密稱定，分別精密加入3,3?,4?-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品溶液1.0 mL（質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL），按“2.2”項下方法制備供試品溶液，分別按“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算得到3,3?,4?-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的平均加樣回收率為105.58%，RSD 為2.27%。

2.9 樣品測定

分別取15 批不同產(chǎn)地的羊開口樣品粉末各約2.0 g，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算各樣品中3,3?,4?-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量，結(jié)果見表2。由表2 結(jié)果可知，15 批羊開口樣品中均可檢出3,3?,4?-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，但產(chǎn)地不同，樣品中 3,3?,4?-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量差異較大。造成各地區(qū)產(chǎn)生含量差異的原因，可能是因為廣西地處中國地勢第二階梯中的云貴高原東南邊緣，地勢呈現(xiàn)西北向東南傾斜，地貌復(fù)雜多變，土壤酸性有差異，氣候帶較多，各地光照和氣溫不同，使羊開口的生長和3,3?,4?-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的成分積累受多方面的影響。此外，羊開口的生長年限、采收期、產(chǎn)地加工方法不同，也會影響其含量。

表2 羊開口中3,3′,4′-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量測定結(jié)果（n＝2）Table 2 Determination of 4-O-β-D-glucopyranosyl-3,3′,4′-tri-O-methylellagic acid in Radix Melastomatis Normalis (n＝2)

3 討論

本實驗考察了不同提取方法（冷浸、超聲和回流）、不同提取溶劑（甲醇、80%甲醇、80%乙醇和80%丙酮）、不同溶劑用量（20、25、50 mL）和不同提取時間（30、60、90 min），結(jié)果以80%丙酮25 mL 超聲提取60 min 效率最高。

本實驗考察了不同流動相（甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液）的洗脫效果。經(jīng)實驗，在其他色譜條件不變的情況下，采用乙腈-0.2%磷酸水溶液為流動相，所得色譜圖中3,3?,4?-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的基線較平穩(wěn)，分離度、峰對稱性最好，故選用乙腈-0.2%磷酸水溶液為本實驗的流動相。

本實驗曾采用PDA 檢測器3D 模式在200～400 nm 對3,3?,4?-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的對照品溶液進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果顯示3,3?,4?-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的最大吸收波長為246 nm，故選擇246 nm 作為本實驗的檢測波長。

由15 批不同產(chǎn)地的羊開口藥材的含量測定結(jié)果可知，3,3?,4?-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量雖有波動，但均能有效檢出，并且具有很好的藥理活性，故將此成分作為羊開口的含量測定指標(biāo)成分是有一定科學(xué)依據(jù)的。為了更好地控制羊開口藥材的質(zhì)量，建議繼續(xù)深入開展不同產(chǎn)地、不同生長年限、不同采收期和不同產(chǎn)地加工方法的羊開口藥材的3,3?,4?-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量測定研究，以便積累數(shù)據(jù)，為制定科學(xué)的含量限度提供實驗依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突