蘆筍莖枯病菌致病機制的研究進展

孫 強，趙 鳳，蘭 波，杜宜新，石妞妞，肖鴻勇，李湘民，陳洪凡，楊迎青*

(1.中華人民共和國黃島海關，山東青島 266555；2.中倉農業科技發展有限公司，山東青島 266555；3.江西省農業科學院植物保護研究所，江西南昌 330200；4.福建省農業科學院植物保護研究所，福建福州 350012；5.江西省農業技術推廣中心，江西南昌 330200)

蘆筍(AsparagusofficinalisLinn)又稱石刁柏，屬百合科(Liliaceae)天門冬屬(Asparagus)，是世界十大名菜之一，在國際市場上被稱為“蔬菜之王”。蘆筍由于其營養價值高，并具有潤肺、鎮咳、祛痰、抑制腫瘤生長等功能，深受人們的喜愛[1- 2]。隨著蘆筍種植面積的逐年擴大，病害的發生也逐年加重，尤其是莖枯病的普遍發生已嚴重影響了蘆筍的產量和質量[3]。莖枯病的發生需要濕熱氣候條件，歐美蘆筍主產區均屬冷涼氣候，因此基本不發生，而中國、越南、泰國等亞洲國家則嚴重發生[4- 5]。長期以來，國內外學者對蘆筍莖枯病進行了多方面、多角度的研究，并取得了一些進展[6-8]。葉琪明[9]從癥狀、病原菌、發生規律、抗性生理和病害防治等5個方面闡述了我國蘆筍莖枯病研究現狀。余智城等[10]就癥狀、病原菌、發生規律、抗性生理和病害防治等方面進行了綜述。張岳平等[11]綜述了蘆筍重要真菌病害的研究進展。鄭金龍等[12]綜述了蘆筍莖枯病及抗病育種的研究進展。由于抗病育種進展緩慢，近年來，越來越多學者開始將注意力轉移到蘆筍莖枯病菌致病機制的研究上，并取得了可喜的成果。因此，筆者著重從蘆筍莖枯病發病規律、病原菌侵染過程及其致病因子細胞壁降解酶3個方面綜述蘆筍莖枯病菌致病機制的最新研究進展，旨在為蘆筍莖枯病抗性育種和有效防控提供依據。

1 蘆筍莖枯病發病規律

1.1 田塊條件與發病的關系不同土質和地勢等田塊條件對蘆筍莖枯病發病的嚴重度有重要影響[13]。土質黏度大、地勢低洼、排水不良等田塊條件均可導致田間積水，加快病原菌的傳播與擴散。同時，田間積水易造成蘆筍長勢差、對病原菌的抵抗力下降，嚴重時還可造成爛根，加速蘆筍莖枯病的擴展和蔓延，導致病情加重。土質疏松、地勢較高、排灌條件良好等田塊條件可以有效防止田間積水，降低田間小氣候濕度，不利于病原菌分生孢子的傳播、擴散和萌發，同時還可以促進蘆筍的生長發育，增強對病原菌的抵抗力，降低病株率[14]。

1.2 溫濕度對發病的影響高溫、多雨的氣候條件易造成田間小氣候濕度過大，有利于蘆筍莖枯病菌Phomopsisasparagi(Sacc.) Bubak分生孢子的傳播、擴散和侵染。田間定株系統觀察結果表明，蘆筍莖枯病的發生流行與溫濕度密切相關[15-17]。陳須文等[14]的研究結果表明，2月下旬至3月上旬，當旬平均溫度高于8 ℃、相對濕度在77%以上時，出土的蘆筍母莖開始發病；當旬平均溫度高于17 ℃、相對濕度在85%以上時，病原菌侵染和擴散的速度加快；5—6月，當旬平均溫度高于24 ℃、相對濕度達到96%以上時，病原菌侵染和擴散的速度進一步加快，進入發病高峰期，病株率最高可超過90%，病情指數最高可超過60(圖1)。因此，應在發病初期和盛期及時噴藥，控制此病擴散和蔓延[18]。

1.3 品種與發病的關系不同蘆筍品種對莖枯病抗性存在較大差異[19]。TX-4/SD、UC 157、綠塔、16523-B、B4-a/B20-a、B2-a/SD、B3/TX-6等種質資源對莖枯病的抗性較好，可用于抗病育種的親本材料，并在栽培中結合農藝性狀選擇應用以提高蘆筍對莖枯病的抗性，減少用藥次數和用藥量以節約成本和減少農藥污染，促進蘆筍產業綠色發展[20-22]。

圖1 蘆筍莖枯病田間嚴重發生Fig.1 Serious occurrence of asparagus stem blight stem blight in field

1.4 不同施肥方式對蘆筍莖枯病的影響蘆筍的長勢、抗病性和產量與不同施肥方式存在顯著相關性。過多施用氮肥，易造成枝葉過于繁茂，增加田間小氣候濕度，病害發生加重[14,17]。而施用腐復混肥，并合理配比氮、磷、鉀(N∶P∶K=1∶0.7∶1.4)，可有效促進蘆筍生長，提高蘆筍的抗病性，病害發生較輕[14]。

2 蘆筍莖枯病菌的侵染過程

2.1 越冬孢子的釋放萌發蘆筍莖枯病菌Phomopsisasparagi(Sacc.) Bubak主要以分生孢子器在枯死的病殘體上越冬。蘆筍莖枯病菌Phomopsisasparagi(Sacc.) Bubak分生孢子的釋放期為4月26—7月30日，其中4月26—7月9日為釋放盛期。分生孢子在1%鮮蘆筍煎汁培養液中的萌發率為73.9%～97.2%，而在清水中幾乎不能萌發。分生孢子的釋放必須要有水露條件，在無水露的條件下則不能釋放[17]。

2.2 初侵染菌源田間沒有清除干凈遺留的越冬病殘體是翌年早春發病的主要初侵染菌源。試驗調查結果證明，田間蘆筍的發病期與越冬病殘體上分生孢子的釋放期幾乎一致。早春最初發現的莖枯病病株，多為田間沒有清除干凈遺留的越冬病殘體附近的筍株，大多在病殘體旁邊或者距離越冬病殘體20 cm以內，發病筍株的病斑面與病殘體所在方向一般保持一致，且多在莖稈基部首先發病。田間沒有清除干凈病殘體的筍蔸往往成為早春莖枯病發生的發病中心[17]。

2.3 病害侵染循環在病殘體上越冬的分生孢子器，翌年春遇雨水或灌溉水釋放分生孢子并侵染蘆筍莖稈基部及葉尖等部位。蘆筍莖枯病菌Phomopsisasparagi(Sacc.) Bubak主要靠風雨傳播，因此雨水較多的年份和季節發病也較重。病原菌從侵入到分生孢子器成熟釋放新的分生孢子為一個侵染周期，在23～27 ℃時侵染周期為10～12 d，在17～20 ℃時侵染周期為15～20 d。6—10月，蘆筍莖枯病菌Phomopsisasparagi(Sacc.) Bubak分生孢子在田間不斷擴散、萌發、侵染形成新的發病中心，并持續不斷釋放分生孢子完成再侵染，導致田間病情逐漸加重[17]。筆者室內培養發現，蘆筍莖枯病菌Phomopsisasparagi(Sacc.) Bubak 24 h內產生芽管，24～36 h后長出菌絲，菌絲繼續生長，4 d后侵入寄主組織，8 d后開始形成產孢結構，12 d后形成分生孢子器，16 d后分生孢子器釋放出分生孢子(α、β型孢子)(圖2);隨著侵染過程的推進，其表觀癥狀逐漸明顯，相對發病面積逐漸增大(圖3)[23]。

2.4 病害消長動態據調查，5月上旬可在田間最早發現蘆筍莖枯病的發病株。蘆筍莖枯病在未采筍的幼株田及提前留母莖的成株采筍田發病較早。適時留母莖的采筍田在留母莖后10 d左右開始發病。7月下旬至8月上旬為病蘆筍莖枯病的發展期，田間平均病株率在5%～10%，平均病情指數在1%～5%。8月中旬后，隨降雨量的逐漸加大和氣溫的迅速升高，進入蘆筍莖枯病的發生高峰期，田間出現大量枯死筍株[14]。

3 蘆筍莖枯病菌細胞壁降解酶

3.1 細胞壁降解酶種類根據作用蘆筍組織的不同，可將蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak降解酶分為角質層降解酶(cutinase)和細胞壁降解酶(celll wall degrading enzymes)等酶類。根據作用底物的不同，蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak細胞壁降解酶又可細分為纖維素酶(cellulose)、半纖維素酶(hemicellulase)和果膠酶(pectic enzyme)等酶類。根據作用方式的不同，可將蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak細胞壁降解酶分為裂解酶和水解酶等酶類[24-25]。常見的蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak細胞壁降解酶主要有以下7種：多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)、β-1,4-內切葡聚糖酶(endo-β-1,4-glucanase，Cx)、果膠甲基半乳糖醛酸酶(polymethylgalacturonase，PMG)、濾紙酶(filter paper enzyme，FPA)、果膠甲基酯酶(pectin methylesterase，PE)、果膠甲基反式消除酶(pectin methyltrans-eliminase，PMTE)和多聚半乳糖醛酸反式消除酶(polymethylgalacturonase trans-eliminas，PGTE)[23-24]。其中，多聚半乳糖醛酸酶(PG)、β-1,4-內切葡聚糖酶(Cx)、果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、濾紙酶(FPA)和果膠甲基酯酶(PE)等細胞壁降解酶屬于水解酶，而果膠甲基反式消除酶(PMTE)和多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PGTE)等細胞壁降解酶屬于裂解酶[25-27]。

圖2 蘆筍莖枯病菌侵染過程[23]Fig.2 Infection process of asparagus stem blight fungus[23]

圖3 蘆筍莖枯病菌侵染過程中的癥狀和病情[23]Fig.3 Symptom and disease severity of asparagus stem blight fungus in the infection process[23]

3.2 細胞壁降解酶的提取及純化

3.2.1離體培養液中細胞壁降解酶的提取。蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak細胞壁降解酶的離體培養一般是在改良的Marcus培養液中靜置培養6～8 d后進行提取和純化[23-24]。主要方法為：① 將蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂粉培養基(PDA)平板上培養5～8 d。② 用5或7 mm打孔器在平板菌落邊緣打孔，挑取5～8塊菌絲塊置于裝有50～100 mL改良Marcus培養液的250 mL量程的三角瓶中，靜置培養6～8 d。③ 首先用3層紗布過濾以除去菌絲塊和菌絲等雜質，然后再經過雙層濾紙抽濾以繼續除去雜質。④ 4 ℃、11 000～13 000 r/min下離心10～20 min，留上清(粗酶液)。⑤ 在粗酶液中加60%飽和度的(NH4)2SO4，4 ℃下靜置24～48 h，然后4 ℃、11 000～13 000 r/min下離心10～20 min，棄上清液。⑥ 用適量50 mmol/L HAc-NaAc緩沖液溶解沉淀，在HAc-NaAc緩沖液中透析24～48 h，期間換2～4次50 mmol/L HAc-NaAc緩沖液，得到的酶液于-80 ℃冰箱保存備用[23-24]。

3.2.2組織內細胞壁降解酶的提取。從人工接種發病的蘆筍莖稈切取具有典型癥狀的病組織。每克鮮組織中加入5 mL 0.25 mol/L NaCl提取液(用0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液配制，pH 8.0)，加5～8粒石英砂或不銹鋼研磨珠，在冰浴中研磨。首先用3層紗布過濾以去除組織、石英砂或不銹鋼研磨珠等雜質，然后再經過雙層濾紙抽濾繼續去除雜質；在4 ℃、12 000 r/min下離心10～20 min，取上清液，即為粗酶液，粗酶液中加60%飽和度的(NH4)2SO4，4 ℃下靜置24～48 h，然后4 ℃、11 000～13 000 r/min下離心10～20 min，棄上清液。用適量50 mmol/L HAc-NaAc緩沖液溶解沉淀，在HAc-NaAc緩沖液中透析24～48 h，期間換2～4次50 mmol/L HAc-NaAc緩沖液，得到的酶液于-80 ℃冰箱保存備用[25,28-29]。

3.3 蘆筍莖枯病菌細胞壁降解酶活性

3.3.1幾種主要細胞壁降解酶活性的測定。分別繪制牛血清蛋白標準曲線、葡萄糖標準曲線、D-半乳糖醛酸標準曲線，并獲得相應一次回歸方程。牛血清蛋白標準曲線用于計算細胞壁降解酶濃度，葡萄糖標準曲線用于計算β-1,4-內切葡聚糖酶(Cx)和濾紙酶(FPA)等酶類的活性，D-半乳糖醛酸標準曲線用于計算多聚半乳糖醛酸酶(PG)和果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)等酶類活性。用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測定蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak待測酶液的OD540值，用OD540值大小反應酶反應所釋放的還原糖量，OD540值代入一次回歸方程，分別計算多聚半乳糖醛酸酶(PG)、β-1,4-內切葡聚糖酶(Cx)、果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)和濾紙酶(FPA)等酶類的活性[30]；利用NaOH滴定法測定膠甲基酯酶(PE)等酶類的活性，根據酶作用后所釋放的羧基數量來確定酶活性[31]；測定果膠甲基反式消除酶(PMTE)和多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PGTE)等酶類的OD232值，并據此計算其活性[25,28]。

3.3.2蘆筍莖枯病菌細胞壁降解酶活性研究進展。蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak產生的細胞壁降解酶中以多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)和β-1,4-內切葡聚糖酶(Cx)3種酶的活性較高，其中多聚半乳糖醛酸酶(PG)和果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)等酶類屬于果膠酶，β-1,4-內切葡聚糖酶(Cx)等酶類屬于纖維素酶[23,27]。筆者利用3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)測定了7種蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak常見細胞壁降解酶的活性，明確了不同底物對3種主要酶的誘導效果，從溫度、時間和pH 3個方面對蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak幾種主要細胞壁降解酶的活性測定條件進行了優化。7種蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak細胞壁降解酶中，以多聚半乳糖醛酸酶(PG)的活性較高，其次是果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)和β-1,4-內切葡聚糖酶(Cx)，其他4種酶的活性較低。在3種蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak主要細胞壁降解酶中，β-1,4-內切葡聚糖酶(Cx)以1%CMC作為底物進行誘導產生的酶量較多，多聚半乳糖醛酸酶(PG)和果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)則以1%果膠作為底物進行誘導產生的酶量較多。在50 ℃下測定β-1,4-內切葡聚糖酶(Cx)活性的效果較好，在50～60 ℃下測定多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性的效果較好，在60 ℃測定果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)酶活性的效果較好；反應50 min后測定β-1,4-內切葡聚糖酶(Cx)酶活性的效果較好，反應60 min后測定多聚半乳糖醛酸酶(PG)和果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)2種細胞壁降解酶活性的效果較好；pH 4.0下測定β-1,4-內切葡聚糖酶(Cx)和多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性的效果較好，pH 8.0下測定果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)的效果較好[23-24]。

3.4 細胞壁降解酶生理學研究蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak細胞壁降解酶對蘆筍組織具有重要的損傷作用[23]。筆者從滲透性還原單糖量釋放和相對電導率增大量等方面，測定了蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak細胞壁降解酶對蘆筍組織的浸解作用。蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak細胞壁降解酶浸解蘆筍組織28 h后，蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak細胞壁降解酶能夠顯著提高滲透性還原單糖的量。隨著蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak細胞壁降解酶濃度的增大，釋放的滲透性還原單糖的量逐漸增大。說明隨著蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak細胞壁降解酶濃度的增大，其造成的蘆筍組織損傷嚴重程度逐漸增加。通過相對電導率的測定，明確了蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak細胞壁降解酶對蘆筍組織細胞膜的損傷作用。隨著蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak細胞壁降解酶濃度的增大，測得的相對電導率逐漸增大。說明蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak細胞壁降解酶濃度越大，其對蘆筍組織細胞膜造成的損傷程度越大[23]。

4 展望

近年來，越來越多的學者認識到研究植物病原真菌致病機制的重要性，并著手從發病規律、侵染過程和致病因子等方面進行了較為深入的探討。蘆筍莖枯病是一種區域性分布的毀滅性病害，俗稱“蘆筍癌癥”。其發病規律、侵染方式及過程目前已經明確。細胞壁降解酶作為蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak的一個重要致病因子，其對蘆筍組織具有重要損傷作用，其作用機制有待于進一步深入研究和探討。目前關于蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak細胞壁降解酶的研究多圍繞酶活性、細胞器損傷等方面展開，在細胞壁降解酶的分離、相關酶成分等電點測定、疏水性等各種蛋白學方面的研究較少。此外，蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak主要細胞壁降解酶調控基因的研究鮮見報道，有待進一步的深入研究。總之，蘆筍莖枯病菌P.asparagi(Sacc.) Bubak致病機理的闡明，對于蘆筍莖枯病抗性育種及有針對性進行防治具有重要的理論和實踐意義，也充分展現了其廣闊的應用前景。