長莖葡萄蕨藻營養(yǎng)成分分析

劉莉萍，林素轉(zhuǎn)，金 剛，沈 麗*，周 靖

(1.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東深圳 518055；2.深圳市計量質(zhì)量檢測研究院，廣東深圳 518073)

長莖葡萄蕨藻(Caulerpalentillifera)隸屬綠藻門(Chlorophyta)[1]，是一種高蛋白、高纖維、低脂肪，且富含維生素、氨基酸、礦物質(zhì)及不飽和脂肪酸等的可食用綠藻[2-5]，但因其對生長環(huán)境及水質(zhì)的要求高，人工養(yǎng)殖難度較大，目前國內(nèi)僅分布于福建、海南及廣東等地?，F(xiàn)階段國內(nèi)外對長莖葡萄蕨藻的相關(guān)研究文獻尚不夠豐富，其食用及開發(fā)利用的多樣性因此也比較有限[6-7]。該試驗以長莖葡萄蕨藻為研究對象，采用氨基酸比值系數(shù)法分析其氨基酸組成及蛋白質(zhì)含量，進而評價其營養(yǎng)價值，為合理開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1試材。長莖葡萄蕨藻來源于深圳某岸基廠房式水泥池養(yǎng)殖場，冷凍-80 ℃保存。 將試樣用淡水沖洗清除表面殘留物，再用去離子水洗3～5次。按長莖葡萄蕨藻的生長階段特點，將藻逐一區(qū)分并對應(yīng)編號，包括匍匐莖(I)以及長度分別<3 cm(Ⅱ)、3～5 cm(Ⅲ)、>5～7 cm(Ⅳ)、>7～10 cm(Ⅴ)、>10 cm(VI)的直立枝這6類樣品，分別于100 ℃烘箱中烘干至恒重后粉碎，過100目篩后，存于干燥器備用。

1.1.2試劑。氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合儲備液，包括天冬氨酸(Asp)、蘇氨酸(Thr)、絲氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、脯氨酸(Pro)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、胱氨酸(Cys)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lys)、組氨酸(His)、精氨酸(Arg)、氯化銨(NH4Cl)18種物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每種氨基酸濃度為2.5 μmol/mL，日本和光純藥工業(yè)株式會社。濃鹽酸，濃度≥36%，分析純，廣州市東紅化工廠；茚三酮顯色液，購自日本和光純藥工業(yè)株式會社；超純水，電阻率≥18.2 MΩ·cm(25 ℃)；硫酸銨、檸檬酸鈉、硼酸、硫酸銅、檸檬酸、乙醇、氯化鈉、硫酸鉀、95%乙醇、硫酸、氫氧化鈉，均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3儀器設(shè)備。Kjeltec 8200凱氏定氮儀，福斯分析儀器(蘇州)有限公司；L-8900高速全自動氨基酸分析儀，日本日立(HITACHI)；AB204-S電子分析天平，梅特勒-托利多公司；RX-UPTC超純水機，上海睿析科學(xué)儀器有限公司；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；SA-N2-10C氮氣發(fā)生器，英國PerMuta通用實驗科技國際有限公司；JYL-C012多能料理機，九陽股份有限公司；HW·SY11K恒溫水浴鍋，北京市長風(fēng)儀器儀表公司。

1.2 試驗方法

1.2.1試樣制備。使用多功能料理機將已烘干至恒重的6類長莖葡萄蕨藻樣品分別磨成粉末后，裝至密封袋中。

1.2.2氨基酸的測定。

1.2.2.1試樣預(yù)處理。準(zhǔn)確稱取約0.02 g(精確至0.1 mg)的待測長莖葡萄蕨藻粉末于30 mL玻璃水解管中，分別加入6 mol/L的鹽酸15 mL，充氮氣5 min并封口，110 ℃水解22 h。將水解后的液體轉(zhuǎn)移到250 mL燒杯中，60 ℃水浴蒸干，用0.02 mol/L的鹽酸沖洗并倒入25 mL容量瓶中，定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過濾后存于安培瓶。

1.2.2.2標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制。用0.2 mol/L鹽酸將氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合儲備液稀釋成濃度為0、0.01、0.05、0.10、0.20、0.40、0.50 μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)混合工作液。

1.2.2.3工作條件選擇。氨基酸分析儀參數(shù)設(shè)定：色譜柱為4.6 mm×60 mm(填料2622)，柱溫57 ℃，檢測波長為570 nm(Asp、Thr、Ser、Glu、Gly、Ala、Cys、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys、His、Arg)、440 nm(Pro)，柱后衍生劑為茚三酮溶液，其梯度洗脫程序見表1。

1.2.2.4水解時間的單因素試驗。在保證長莖葡萄蕨藻樣品其他處理條件一致的情況下，進行水解時間分別為8、18、22、26、38 h的單因素試驗，測定對應(yīng)樣品中的氨基酸含量。

1.2.2.5試樣測定。將長莖葡萄蕨藻樣品處理所得的溶液于570 nm波長檢測Asp、Thr、Ser、Glu、Gly、Ala、Cys、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys、His、Arg,Pro在440 nm波長下進行檢測，采用單點校正法定量分析。

1.2.2.6氨基酸營養(yǎng)價值評價。根據(jù)世界衛(wèi)生組織/聯(lián)合國糧農(nóng)組織(WHO/FAO)共同修訂的理想蛋白質(zhì)人體必需氨基酸模式譜(1973年版本)[8]，分析長莖葡萄蕨藻的氨基酸營養(yǎng)價值。主要指標(biāo)包括氨基酸總量(TAA)、必需氨基酸總量(EAA)、非必需氨基酸總量(NEAA)、必需氨基酸的氨基酸比值(RAA)、氨基酸比值系數(shù)(RC)和比值系數(shù)分(SRC)。

1.2.3蛋白質(zhì)的測定。

1.2.3.1試樣預(yù)處理。參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》[9]，準(zhǔn)確稱取約1 g(精確至0.1 mg)長莖葡萄蕨藻樣品放于消化管中，加入3 g硫酸鉀、0.2 g硫酸銅、12 mL 硫酸，于消化爐消化，直至溫度達到420 ℃，繼續(xù)消化1 h，最終試液呈淡綠色近透明狀，冷卻后取出。

1.2.3.2分析程序。用自動凱氏定氮儀測定預(yù)處理后的樣品中的蛋白質(zhì)含量，分析程序設(shè)定為稀釋液80 mL、堿50 mL、接受液30 mL、模式時間5 s、蒸餾時間5 min、消化管排空、安全模式、蒸汽量100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理使用Excel 2013整理測定數(shù)據(jù)、 SPSS統(tǒng)計軟件進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸測定

2.1.1氨基酸測定最佳條件。不同水解時間條件下測定Asp、Thr、Ser、Glu、Pro、Gly、Ala、Cys、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys、His、Arg共17種氨基酸總含量(以干重計)，結(jié)果見表2。由表2可知，不同水解時間下各藻樣中氨基酸含量的變化趨勢接近，其中水解22 h的氨基酸總量相對較大且變化趨勢較平穩(wěn)，故確定最佳水解時間為22 h。

表2 不同水解時間條件下的長莖葡萄蕨藻總氨基酸含量Table 2 Total amino acid content of Caulerpa lentillifera under different hydrolysis time 單位：g/kg

2.1.2氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合液測定。17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合液色譜圖見圖1。由圖1可知，17個氨基酸峰之間的分離度均大于1.2，柱效穩(wěn)定，分離效果良好。各氨基酸保留時間如表3所示。

圖1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合液色譜圖Fig.1 Chromatogram of amino acid standard mixture

表3 氨基酸及氨保留時間Table 3 Retention time of amino acids and ammonia

2.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。在優(yōu)化儀器工作條件下測定相應(yīng)氨基酸的信號響應(yīng)值，以相應(yīng)氨基酸的濃度(x)為橫坐標(biāo)、峰面積(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍為0～0.50 μmol/mL，結(jié)果見表4。由表4可知，所繪制的各氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)(r)均不小于0.998 7，且各氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。

2.1.4方法的精密度考察。選取長莖葡萄蕨藻試樣進行精密度試驗，平行測定6次，結(jié)果見表 5。由表5可知，17種氨基酸的 RSD 均不大于6.5%，具有良好的精密度。

2.1.5方法的準(zhǔn)確度考察。選取長莖葡萄蕨藻試樣，按優(yōu)化的工作條件，加入1.00 mL 0.4 μmol/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進行加標(biāo)回收率驗證，平行測定3次，結(jié)果見表6。 由表6可知，17種氨基酸的加標(biāo)回收率在90.51%～103.50%，方法準(zhǔn)確可靠。

2.1.6不同生長階段各氨基酸含量測定。與氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合液相同條件下測定不同生長階段的長莖葡萄蕨藻樣品，探究其氨基酸含量與生長時間的關(guān)系，結(jié)果見表7。由表7可知，隨著生長時間的增加，長莖葡萄蕨藻氨基酸含量呈現(xiàn)先增加而后趨于穩(wěn)定的趨勢。方差分析結(jié)果顯示，P值>0.05，F(xiàn)

表4 17種氨基酸線性關(guān)系Table 4 Linear relationship of 17 amino acids

表5 方法的精密度(n=6)Table 5 Precision of the method

表6 優(yōu)化方法的準(zhǔn)確度Table 6 Accuracy of optimization method

2.1.7氨基酸組分分析。采用上述測定中各氨基酸含量的平均值，對長莖葡萄蕨藻樣品的氨基酸組分進行必需氨基酸和呈味氨基酸的含量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表7)，長莖葡萄蕨藻樣品中17種氨基酸含量為204.7 g/kg(以干重計)；長莖葡萄蕨藻中氨基酸含量較高的為Glu(22.4 g/kg)、Asp(21.9 g/kg)、Gly(21.3 g/kg)，三者總占比為32.05%。呈味氨基酸中鮮味氨基酸(Glu、Asp)含量最高，占總量的21.64%；其次是甜味氨基酸(Gly、Ala)，占總量的16.90%；所有呈味氨基酸總和占總量的48.80%。長莖葡萄蕨藻獨特的鮮味可能與其中高含量的呈味氨基酸有關(guān)。

2.1.8必需氨基酸含量。根據(jù)FAO/WHO推薦的理想蛋白質(zhì)模式譜，當(dāng)EAA/TAA為40%左右、EAA/NEAA在60%以上時，蛋白質(zhì)質(zhì)量較好。由表7可知，長莖葡萄蕨藻中EAA/TAA為37.47%，EAA/NEAA為66.41%，可見長莖葡萄蕨藻的氨基酸組成完全符合理想蛋白質(zhì)模式譜。

2.1.9氨基酸營養(yǎng)價值評價。氨基酸比值系數(shù)法是以氨基酸平衡理論為基礎(chǔ)，通過對比目標(biāo)物質(zhì)中必需氨基酸比例與 FAO/WHO 氨基酸模式譜之間的差距大小來評價氨基酸營養(yǎng)，通常比例與模式譜越接近，營養(yǎng)價值越高[10]。將表7中長莖葡萄蕨藻必需氨基酸EAA值與FAO/WHO模式譜中相應(yīng)氨基酸的EAA值進行比較，并計算長莖葡萄蕨藻的RAA、RC和SRC，結(jié)果見表8。由表8可知，長莖葡萄蕨藻的必需氨基酸總量高于 FAO/WHO 氨基酸模式譜，其中有Thr、Val、 Ile、Leu、Phe+Tyr 這5項符合且高于模式譜要求，Met+Cys、Lys也很接近模式譜要求。長莖葡萄蕨藻SRC值為70.3，營養(yǎng)價值與利用率較高，很適合作為食用性人體蛋白源。

表7 不同生長階段的長莖葡萄蕨藻各氨基酸測定結(jié)果Table 7 Determination results of amino acids in Caulerpa lentillifera at different growth stages 單位：g/kg

表8 長莖葡萄蕨藻中必需氨基酸占總氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與模式譜比較Table 8 Comparison between the mass fraction of essential amino acids of Caulerpa lentillifera in the total amino acids and the model spectrum

2.2 蛋白質(zhì)測定

2.2.1方法的精密度考察。對長莖葡萄蕨藻樣品進行6個平行處理，使用自動凱氏定氮儀進行蛋白質(zhì)含量測定(以干重計)，結(jié)果見表9。由表9可知，蛋白質(zhì)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均不大于1.39%，表明該儀器性能穩(wěn)定。

2.2.2方法的準(zhǔn)確度考察。對長莖葡萄蕨藻樣品進行兩平行兩加標(biāo)處理，計算其回收率，結(jié)果見表10。由表10可知，其平均回收率為100.79%，說明該儀器測定結(jié)果準(zhǔn)確度高。

表9 方法的精密度(n=6)Table 9 Precision of the method

表10 方法的準(zhǔn)確度Table 10 Accuracy of the method

2.2.3樣品蛋白質(zhì)的測定。對長莖葡萄蕨藻樣品進行2個平行處理，測定蛋白質(zhì)含量(以干重計)，結(jié)果見表11。由表11可知，隨著生長時間的增加，長莖葡萄蕨藻蛋白質(zhì)含量與氨基酸含量(表7)變化相似，均呈現(xiàn)先增加而后趨于穩(wěn)定的趨勢。長莖葡萄蕨藻樣品蛋白質(zhì)平均含量為235.8 g/kg(以干重計)，高于一般海藻(海帶87 g/kg干重[2]，羊棲菜123 g/kg干重[2]，石莼154.0 g/kg干重[2])，是一種良好的藻類蛋白源。

表11 樣品蛋白質(zhì)含量Table 11 Protein content of samples 單位：g/kg

3 結(jié)論

蛋白質(zhì)是人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)。衡量其質(zhì)量的優(yōu)劣，一看其氨基酸是否齊全，二看氨基酸含量組成是否符合理想蛋白質(zhì)模式譜。該研究發(fā)現(xiàn)不同生長期的長莖葡萄蕨藻樣品中各氨基酸含量及總量無明顯差異；長莖葡萄蕨藻樣品中蛋白質(zhì)含量為235.8 g/kg(以干重計)，17種氨基酸含量為204.7 g/kg(以干重計)。長莖葡萄蕨藻中氨基酸種類豐富，含量較高的為Glu、Asp、Gly，三者總占比為32.05%，而3種氨基酸均為呈味氨基酸，具有良好鮮味感和誘食作用，有利于將長莖葡萄蕨藻制作成即食食品和海鮮調(diào)味品。長莖葡萄蕨藻中EAA/TAA為37.47%，EAA/NEAA為66.41%，氨基酸組成完全符合世界衛(wèi)生組織推薦的理想蛋白質(zhì)模式譜，且長莖葡萄蕨藻的必需氨基酸總量高于 FAO/WHO 氨基酸模式譜，大部分指標(biāo)項符合且高于模式譜。長莖葡萄蕨藻SRC值為70.3，營養(yǎng)價值與利用率較高，易于人類吸收，具有較高的食用開發(fā)價值和良好的應(yīng)用前景。