基于TLR3/TRIF通路分析重組人干擾素α2b聯合炎琥寧對病毒性肺炎患兒的療效與作用機制

常 秀，趙 靜，侯召權，程 娜

病毒性肺炎(viral pneumonia, VP)是由合胞病毒、流感病毒等感染引起的一種肺部間質性炎癥，我國肺部感染疾病中VP發病率占50%，其臨床癥狀主要為咳嗽、發熱等，若未及時治療易引起病情持續性進展，甚至出現咯血等癥狀[1]。目前臨床常采用干擾素、利巴韋林等抗病毒藥物治療VP，但長期使用具有一定不良反應[2]。重組人干擾素α2b是一種廣譜抗病毒藥物，可與細胞表面膜受體結合，抑制VP相關病毒復制，并調節機體免疫功能，增強巨噬細胞活性[3]。炎琥寧是一種穿心蓮內脂提取物，具有抗感染、抗病毒等作用，可抑制毛細血管通透性及病毒復制，增加腎上腺皮質激素釋放量，增強巨噬細胞、中性粒細胞吞噬能力，進而抑炎殺菌、減少炎性滲出，減輕機體炎癥反應[4]。有研究表明，炎琥寧對VP、肺炎支原體肺炎等具有良好治療效果，可調節患者機體細胞免疫平衡狀態，促進T淋巴細胞、B淋巴細胞增殖，并滅活呼吸道病毒，減緩氣道黏膜炎性損傷[5]。但重組人干擾素α2b聯合炎琥寧治療VP患兒的具體機制尚未明確。體內動物實驗研究顯示，Toll樣受體3(TLR3)/β干擾素TIR結構域銜接蛋白(TRIF)通路與VP發生發展密切相關，抑制TLR3/TRIF通路可減輕肺組織損傷[6]。TLR3活化可促進TRIF表達，加快病毒擴散，并促進Ⅰ型干擾素、炎性細胞因子生成，加重肺組織炎性損傷[7]。目前TLR3/TRIF通路與VP患兒之間的關系尚未明確。因此，本研究基于TLR3/TRIF通路，探討重組人干擾素α2b聯合炎琥寧治療VP患兒的可能作用機制，為VP治療藥物研究提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1—5月我院收治的VP患兒200例，根據治療方法不同分為對照組和觀察組，每組100例。對照組男48例，女52例；年齡1～5(3.01±0.41)歲；病程13～40(29.16±3.15)h；體溫38.50～39.60(39.08±0.17)℃；體質量15～20(18.24±0.58)kg；病原分布：EB病毒41例，柯薩奇病毒12例，單純皰疹病毒11例，腺病毒15例，混合病毒21例。觀察組男51例，女49例；年齡1～6(3.05±0.45)歲；病程13～45(30.05±4.08)h；體溫38.00～39.70(39.12±0.19)℃；體質量16～21(18.28±0.60)kg；病原分布：EB病毒42例，柯薩奇病毒11例，單純皰疹病毒13例，腺病毒17例，混合病毒17例。2組上述一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，所有患兒及其家屬知情且簽署知情同意書。

1.2納入與排除標準 ①納入標準：符合VP診斷標準[8]；均有發熱、咳嗽、咳痰、呼吸急促甚至呼吸困難等典型肺炎癥狀；聽診雙肺均可聞及濕啰音；肺部X線檢查示片狀、斑片狀浸潤性陰影；入院前未接受其他方案治療；未服用本研究藥物或含有本研究藥物成分的其他藥物；臨床病例資料完整。②排除標準：合并心、肝、脾、肺等臟器功能不全者；對本研究藥物或其成分過敏者；合并其他急性或慢性感染性疾病者；重癥肺炎患兒。

1.3方法

1.3.1治療方法：2組均給予常規治療，包括化痰止咳、鎮靜利尿、解痙平喘等相關藥物治療。對照組在此基礎上給予重組人干擾素α2b(長春生物制品研究所有限責任公司，國藥準字S20010044，規格：100萬單位)治療，每次10萬單位/kg，加0.9%氯化鈉注射液至2 ml，霧化吸入，1/d，連續治療7 d。觀察組在對照組基礎上給予炎琥寧(西安利君制藥有限責任公司，國藥準字H20056516，規格：80 mg)治療，5～10 mg/(kg·d)加入5%葡萄糖注射液100 ml靜脈滴注，1/d，連續治療7 d。

1.3.2采集血液樣本：于治療前后分別采集清晨空腹肘部靜脈血6 ml，其中3 ml以4000 r/min離心10 min(離心半徑6 cm)，分離血清，置于-80 ℃冰箱待測；另外3 ml血液樣本加入等體積淋巴細胞分離液(上海西格生物科技有限公司)，采用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(PBMC)。

1.3.3PBMC中TLR3、TRIF、核因子-κBp65(NF-κBp65) mRNA表達量：采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測，PBMC中加入1 ml Trizol試劑(美國Invitrogen公司)充分裂解，室溫靜置5 min后加入氯仿200 μl，12 000 r/min離心10 min后吸取上層無色水相層，加入等體積異丙醇，相同條件下再次離心10 min，棄上清，RNA沉于離心管底部。使用反轉錄試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]將RNA反轉錄合成cDNA。TLR3、TRIF、NF-κBp65引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，見表1。qRT-PCR反應體系：cDNA 2 μl，Real-Time Master Mix 10 μl，正反向引物各1 μl，RNase-Free ddH2O補足反應體系至20 μl；反應條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s(共循環40次)。應用ABI StepOnePlus熒光定量PCR儀進行擴增，以GAPDH為參照，采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。

表1 TLR3、TRIF、NF-κBp65引物序列

1.3.4血清免疫球蛋白IgG、IgA、IgM水平：采用免疫散射比濁法檢測血清IgG、IgA、IgM水平，檢測試劑盒由上海一研生物科技有限公司提供。

1.4觀察指標 ①比較2組臨床療效[9]，痊愈為患兒高熱、咳嗽、喘息、肺部啰音等癥狀消失，胸部X線片恢復正常；有效為患兒咳嗽、喘息、肺部啰音等癥狀明顯改善，體溫恢復正常，胸部X線片恢復正常；無效為患兒體溫、咳嗽、喘息、肺部啰音等癥狀無改變，胸部X線片無改變?？傆行?(痊愈+有效)/總例數×100%。②比較2組臨床癥狀改善時間及住院時間，臨床癥狀改善時間包括退熱時間、咳嗽消失時間、呼吸困難消失時間、肺啰音消失時間。③比較2組治療前后PBMC中TLR3、TRIF、NF-κBp65 mRNA表達量。④比較2組治療前后血清IgG、IgA、IgM水平。⑤比較2組治療前后呼吸功能，使用Jaeger肺功能儀(上海聚慕醫療器械有限公司)檢測呼吸頻率(RR)、潮氣量(VT)、呼氣達峰時間(TPTEF)/呼氣時間(TE)。⑥比較2組不良反應發生情況，包括聲嘶、惡心嘔吐、腹瀉、皮疹。

2 結果

2.1臨床療效比較 觀察組臨床總有效率高于對照組(P<0.01)。見表2。

表2 2組病毒性肺炎患兒臨床療效比較[例(%)]

2.2臨床癥狀改善時間及住院時間比較 觀察組退熱時間、咳嗽消失時間、呼吸困難消失時間、肺啰音消失時間及住院時間均短于對照組(P<0.01)。見表3。

表3 2組病毒性肺炎患兒臨床癥狀改善時間及住院時間比較

2.3治療前后PBMC中TLR3、TRIF、NF-κBp65 mRNA表達量比較 治療前，2組PBMC中TLR3、TRIF、NF-κBp65 mRNA表達量比較差異無統計學意義(P>0.05)。治療7 d后，2組PBMC中TLR3、TRIF、NF-κBp65 mRNA表達量較治療前下降，且觀察組低于對照組(P<0.05)。見表4。

表4 2組病毒性肺炎患兒治療前后PBMC中TLR3、TRIF、NF-κBp65 mRNA表達量比較

2.4治療前后血清免疫球蛋白水平比較 治療前，2組血清IgG、IgA、IgM水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。治療7 d后，2組血清IgG、IgA、IgM水平較治療前升高，且觀察組高于對照組(P<0.05)。見表5。

表5 2組病毒性肺炎患兒治療前后血清免疫球蛋白水平比較

2.5治療前后呼吸功能比較 治療前，2組RR、VT、TPTEF/TE比較差異無統計學意義(P>0.05)。治療7 d后，2組RR較治療前下降，VT、TPTEF/TE較治療前升高；且觀察組RR低于對照組，VT、TPTEF/TE高于對照組(P<0.05)。見表6。

表6 2組病毒性肺炎患兒治療前后呼吸功能比較

2.6不良反應發生情況比較 2組不良反應總發生率比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表7。

表7 2組病毒性肺炎患兒不良反應發生情況比較[例(%)]

3 討論

病毒侵襲下呼吸道可引起呼吸道上皮、黏膜損傷，促使氣管、支氣管黏膜水腫，降低呼吸道防御功能，同時隨著炎性滲出、炎性細胞浸潤導致呼吸道管腔阻塞，炎性介質進入肺間質，進而促進VP發生發展[10-11]。

重組人干擾素α2b具有療效確切、靶向性強等特點，可抑制多種病毒合成，研究表明干擾素α2b可提高病變部位抗病毒感染能力，增強機體免疫功能，并通過干預T淋巴細胞等因子表達，降低機體炎性細胞浸潤[12]。炎琥寧還可抑制宿主細胞中病毒復制，抑制流感病毒神經氨酸酶，提高機體免疫球蛋白水平，并能抑制單核細胞、中性粒細胞所致呼吸道炎癥反應[13]。炎琥寧還可抑制白細胞介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎性細胞因子生成，調節T淋巴細胞亞群水平，提升細胞免疫功能[14]。本研究顯示，觀察組臨床總有效率高于對照組，且臨床癥狀改善時間、住院時間短于對照組，表明相較于單獨使用重組人干擾素α2b，聯合炎琥寧治療可提高VP患兒治療效果，改善臨床癥狀。外源性給予重組人干擾素α2b可增強VP患兒抗病毒感染能力，聯合炎琥寧治療可發揮協同作用，增強患兒免疫功能，減輕炎癥反應程度，減緩病情發展進程。免疫球蛋白合成、釋放有利于滅活病毒，IgG、IgA、IgM分布于呼吸道上皮、黏膜，可中和病毒，降低感染發生風險，VP患兒早期存在體液免疫紊亂情況，免疫球蛋白水平可反映機體免疫功能，若IgG、IgM水平降低表明病毒尚未完全清除[15]。本研究顯示，治療7 d后，觀察組血清IgG、IgA、IgM水平高于對照組，表明聯合治療清除病毒能力強于單獨使用重組人干擾素α2b。同時本研究發現，治療7 d后，觀察組RR低于對照組，VT、TPTEF/TE高于對照組。重組人干擾素α2b可產生抗病毒蛋白，刺激免疫細胞，增強機體殺傷病毒能力，并能改善患兒氣道功能[16]。炎琥寧可進一步降低炎性因子水平，緩解呼吸道癥狀，進而改善肺功能[17]。結合本研究結果可知聯合治療可調節T淋巴細胞等免疫細胞水平，增強抗病毒能力，有利于及時清除感染，減輕炎癥反應，進而提升VP患兒呼吸功能。同時本研究發現聯合治療后不良反應總發生率并未明顯增加，提示聯合治療安全性高。

TLR可識別病毒相關分子，并能激活細胞內相關信號轉導途徑，促進特異性基因、趨化因子表達。有研究表明，調節TLR3信號通路可能成為治療炎性疾病的新靶點，TLR3僅募集接頭蛋白TRIF，可通過TRIF激活下游炎性細胞因子[18]。TRIF還可激活NF-κB信號途徑，NF-κB與IκB結合形成p50-p65-IκB三聚體，以無活性狀態存在，病毒感染后IκB磷酸化促使三聚體分離，促使NF-κBp65形成，NF-κBp65可促進IL-6、TNF-α等炎性因子表達，促使單核細胞浸潤，進而促進間質性肺炎產生。另外抑制IL-6、TNF-α表達可降低該信號轉導途徑活化程度，進而發揮抗病毒感染作用[19]。本研究顯示，治療7 d后，觀察組PBMC中TLR3、TRIF、NF-κBp65 mRNA表達量低于對照組，這可能是通過抑制TLR3/TRIF通路，降低炎性因子釋放，促進抗病毒因子合成，而發揮治療VP作用。抑制TLR3表達可增強肺泡巨噬細胞極化、殺菌活性及吞噬能力，并能改善氣道功能和肺功能[20]。這就表明通過抑制TLR3/TRIF通路活化，可改善VP患兒呼吸功能。有研究表明，TLR2、TLR4、TLR3表達上調可抑制IgA分泌，進而加重肺組織炎性損傷[21]。揭示了TLR3/TRIF通路活化可調節VP患兒血清免疫球蛋白水平。TLR3在巨噬細胞等免疫細胞中誘導炎癥反應，促進NF-κB通路相關蛋白表達，故抑制其活性可發揮抗病毒作用，并可能作為治療病毒感染相關疾病的潛在靶基因[22]。炎琥寧成分中穿心蓮可活血消腫、潤肺止咳，可上調IgG、IgA、IgM水平，提升機體免疫能力，并降低炎性因子相關通路活性，進而減輕氣道炎癥反應，改善患者肺功能[23]。由此推測炎琥寧可能通過抑制TLR3/TRIF通路，提升VP患兒血清IgG、IgA、IgM水平，改善其呼吸功能，進而發揮抗病毒感染作用，進一步提高臨床療效。

綜上所述，重組人干擾素α2b聯合炎琥寧在VP患兒中的療效確切，不良反應少，并可改善臨床癥狀和呼吸功能，提升免疫球蛋白水平，其抗病毒機制可能與抑制TLR3/TRIF通路活化有關。