代謝組學技術對非梗阻性無精子癥的診斷價值*

彭紅波，劉 晃，宋小燕，吳瑞珊，孟艷輝，趙文忠

廣東省生殖科學研究所(廣東省生殖醫院)國家衛生健康委員會男性生殖與遺傳重點實驗室，廣東廣州 510600

不孕不育已成為人類重大的健康問題之一，影響全球8%～15%的育齡夫婦，其中50%的生育問題是由男性因素造成的[1]。無精子癥是男性不育癥中最嚴重的類型，主要分為梗阻性無精子癥(OA)和非梗阻性無精子癥(NOA)[2]。OA是指輸精管阻塞或先天性雙側輸精管缺如導致的不育癥，其生精功能正常；而NOA通常是由不明病因的特發性生精功能障礙引起的。目前，關于NOA的發病機制尚不清楚，對NOA發生的分子機制進行研究，并在此基礎上尋找治療NOA的新方法具有重要意義。代謝組學是一種檢測生物樣品中小分子代謝物的方法，該技術以生物指紋標記的方式顯現生物體內遺傳和環境因素所導致的代謝特征，其不僅可展示基因蛋白表達終末產物，而且還可展現接近真實表型的細胞信號事件[3]。高效液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)在代謝組學研究中具有高準確性、穩定性和敏感性的特點[4-5]。血清代謝組學能反映生物體的功能變化，常被用來進行病原分析和病因預測[6]。本研究運用HPLC-MS/MS技術對NOA患者和健康捐精者血清標本進行特征分析，以期發現與生精功能障礙相關的潛在生物標志物，為NOA的病因診斷和治療提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院診治的5例NOA患者為NOA組，患者年齡25～35歲,體質量指數18.5～23.9 kg/m2,無職業及環境暴露，無家族遺傳病史，排除其他重大疾病。另選取廣東省人類精子庫中的5例健康捐精者作為對照組，健康捐精者精液滿足世界衛生組織發布的《人類精液實驗室檢驗手冊(第五版)》相關標準。本研究經本院醫學倫理委員會批準，患者對研究內容知情同意。

1.2非靶向代謝物提取 取100 μL血清置于EP管中，加入400 μL含0.1%甲酸的80%甲醇水溶液，渦旋振蕩，冰浴靜置5 min，15 000×g、4 ℃下離心10 min。取一定量的上清液加入質譜級水稀釋至甲醇含量為53%，置于離心管中15 000×g、4 ℃下離心10 min，收集上清液，按照《非靶向代謝物提取操作手冊》設置條件進樣，采用HPLC-MS/MS進行分析。從每個實驗標本中取等體積標本混勻作為質控標本，將含0.1%甲酸的53%甲醇水溶液作為空白標本。

1.3代謝物的鑒定 將下機數據(.raw)文件導入CD搜庫軟件中，進行保留時間、質荷比等參數的簡單篩選，然后對不同標本根據保留時間偏差0.2 min和質量偏差5 ppm進行峰對齊，使鑒定更準確，隨后根據設置的質量偏差5 ppm，信號強度偏差30%，信噪比為3，最小信號強度為100 000，加和離子等信息進行峰提取，同時對峰面積進行定量，再整合目標離子，然后通過分子離子峰和碎片離子進行分子式的預測，并與mzCloud、mzVault和 Masslist數據庫進行比對。

1.5潛在生物標志物的篩選 以VIP>1.0、FC>1.5或FC<0.667且P<0.05對鑒定到的差異代謝物進行篩選。在此基礎上進行差異代謝物聚類分析和差異代謝物相關性分析。

1.6代謝組學途徑分析 為了確定NOA被影響的可能代謝途徑，通過MetPA對篩選出的代謝物進行代謝組學途徑分析，MetPA基于京都基因和基因組百科全書(KEGG)數據庫。通過KEGG富集分析來確定差異代謝物行使的主要生物學功能。

2 結 果

2.1基本資料分析 NOA組平均年齡為(30.4±2.5)歲，對照組平均年齡為(28.1±2.5)歲,兩組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2總樣本PCA結果 對數據進行初步分析，從NOA組和對照組觀察到分離的趨勢[R2X=0.588，Q2=0.115，4個成分]，見圖1A。通過PLS-DA發現，兩組出現明顯分離，見圖1B。100個隨機排列也顯示PLS-DA方法是可靠的，并且未檢測到過擬合數據，兩組代謝物差異分析結果為存在明顯差異，見圖1C。

注：A為PCA圖；B為PLS-DA圖；C為OPLS-DA圖。

2.3NOA潛在生物標志物的篩選 經比較分析，共鑒定出21種代謝物可作為NOA潛在生物標志物，見表1。NOA組和對照組間的差異代謝物進行層次聚類分析，通過熱圖的顏色顯示，本研究選擇的兩組樣本存在明顯差異。

表1 NOA潛在生物標志物

續表1 NOA潛在生物標志物

差異代謝物分析結果顯示，可分成上調和下調兩組，上調的包括PE (14∶0e/2∶0)、3-羥基-4-甲氧基苯乙酸、三角洲三癸內酯、4-甲基兒茶酚、DL-3,4-二羥基苯基乙二醇、GM3 d34∶1；[M-H]、3-(2-萘基)-D-丙氨酸、法赫法、18-β-甘草次酸、N1-環己基-4-(4-氟芐基)-1,4-二氮烷-1-硫代甲酰胺、溶血磷脂酸22∶6、花生四烯酸、2-(3,4-二甲氧基苯基)乙胺、溶血磷脂酸18∶2、溶血磷脂酸；與對照組相比，上述代謝物在NOA組中的水平更高。下調的有4-甲基-2-氧代-1,2-二氫喹啉-3-碳腈、2-氰基-3-(四氫-3-硫苯基氨基)丙烯酸乙酯、硫酸雌酮、葡萄糖醛酸雄激素、LPC；與對照組相比，上述代謝物在NOA組中的水平較低。

2.4NOA代謝組學途徑分析 通過KEGG富集分析發現，兩組標本在不飽和脂肪酸代謝和類固醇激素生物合成方面存在顯著差異代謝物(圖2)，這些代謝物主要與精子發生中的能量產生、氧化應激和細胞凋亡密切相關。

圖2 KEGG富集分析

3 討 論

代謝組學是繼基因組學和蛋白質組學之后新近發展起來的一門學科，是系統生物學的重要組成部分。代謝組學的概念來源于代謝組，代謝組是指某一生物或細胞在一特定生理時期內所有的低分子量代謝物，代謝組學則是對某一生物或細胞在一特定生理時期內所有低分子量代謝物同時進行定性和定量分析的一門新學科[7]。代謝組學作為一種新興的技術在男性生殖領域受到越來越多的關注，代謝組學的評估結果不僅代表基因/蛋白質表達的最終產物，也是最終細胞信號事件產生的原因——基因組/蛋白質組與環境刺激的相互作用，更接近于實際表型[8]。血清代謝組學分析技術檢測靈敏度高，檢測標本易于獲取，常作為疾病早期小分子代謝物變化情況的重要檢測手段[9]。血液中的代謝物作為所有細胞代謝過程的產物，在反映疾病和環境變化方面有著較高的靈敏度與特異度，也是代表所有器官生理功能的終末產物，形成對個體當前生理狀態的詳細系統表征[10]。

目前，采用代謝組學方法解析男性不育的原因及機制成為研究熱點，在男性不育人群中，血清代謝組學表現出不同的代謝活動模式[11]。類固醇激素作為內分泌干擾物的重要組成部分,其較低水平就能引起生物體發育異常和生殖障礙等。不同的類固醇有不同的作用，其中膽固醇主要是構成細胞膜和細胞器膜的一種組分，其可以調節生物膜脂質的物理狀態，保持膜的流動性，還可以合成膽汁酸和類固醇激素前體。膽汁酸可以與牛磺酸或甘氨酸形成結合物膽汁鹽，膽汁鹽的生理功能主要是分泌到腸內，促進脂質的乳化與吸收。類固醇激素的變化影響糖代謝、脂代謝，進而影響男性生殖發育。花生四烯酸是天然存在的ω-6必需脂肪酸，其也是前列腺素合成的主要直接前體,前列腺素與體育鍛煉后蛋白質合成和肌肉肥大的關系密切[12-13]。葡萄糖醛酸雄激素在肝臟和睪丸中產生，其是睪酮激素的一種代謝物，可以發揮與激素前導物一樣的作用,同時其也是男性體內一種作用較強的性激素。本研究結果顯示，NOA組患者硫酸雌酮、葡萄糖醛酸雄激素水平低于對照組，4-甲基兒茶酚、花生四烯酸、溶血磷脂酸水平高于對照組。NOA組與對照組代謝物相比，有獨特的血清代謝特征，其中部分代謝物與精子發生中的能量產生、氧化應激和細胞凋亡密切相關。

精子發生是睪丸生精小管(STs) 內的精原干細胞(SSCs)分化為成熟精子的復雜過程，是研究男性生殖功能的關鍵環節。SSCs必須維持自我更新和分化的平衡，才能使精子源源不斷地產生。整個生精過程大約需要74 d，貫穿于機體整個生命過程中。男性每天的精子產量為每個睪丸4 500萬個，睪丸結構、生精細胞和支持細胞等在精子發生過程中起著重要作用，而酶、激素、信號因子等一系列因素是調節細胞增殖和凋亡的重要因素，最終影響男性生育。根據近年來的研究報道，精子發生過程中已知的信號通路歸納為以下3種：(1) PI3K/Akt信號通路；(2)cAMP信號通路；(3)mTOR信號通路[14]。PI3K/Akt信號通路對于生精細胞增殖和凋亡均具有重要調控作用;cAMP信號通路參與精子超激活運動、頂體反應及精卵結合等過程;mTOR信號通路對生精過程中減數分裂細胞及其子細胞的正常發育起著調節作用[15]。本研究中，參與精子發生的mTOR信號通路、PI3K/Akt信號通路及cAMP信號通路都受到一定程度的影響，從而影響精子生成，導致NOA的出現。

本研究也存在一定的局限性，一是NOA患者的樣本量較小，雖然在這些NOA患者中發現了一些代謝紊亂，但還需要增加樣本量，進一步研究驗證潛在的發病機制；二是由于機體代謝活動容易受到環境、生活方式和飲食等各種因素的影響，受試者個體間的代謝差異沒有很好的控制。因此，為了消除這些混雜因素的影響，需要制訂更嚴格的研究對象選擇標準和開展動物模型研究。

本研究通過對機體的整體代謝組分分析發現了NOA獨特的代謝模式，找出了一些特異性生物標志物，有助于臨床對NOA進行及時、準確的診斷，并為男性不育的發病機制研究提供了新的方向，為研究疾病新型治療策略提供了理論依據。