HPLC 指紋圖譜結合網絡藥理學預測北蒼術功效關聯物質

翁麗麗，曾行調，王孟聰，種湘歌，李宜平

（長春中醫藥大學藥學院，吉林 長春 130117）

北蒼術Atractylodes chinensis（DC.）Koidz.為菊科多年生草本植物，主產于河北、吉林、遼寧等地，具有燥濕健脾、祛風散寒、明目等功效［1-2］。揮發油是北蒼術的主要化學成分，包括蒼術素、蒼術酮、β-桉葉醇等，是其發揮療效的藥用物質基礎，具有抑制炎癥反應、調控腫瘤生長、保護神經系統等藥理作用［3-4］。

目前國內外北蒼術需求量不斷增加，華北、東北地區北蒼術野生資源由于過度采挖而被破壞，北蒼術野生品蘊藏量急劇下降。栽培品逐漸取代野生品成為市場主流，但由于種植技術不規范、產地差異及偽品、劣品的出現，導致市場上北蒼術質量參差不齊。因此，建立全面合理的北蒼術藥材質量評價方法尤為重要。近年來，對北蒼術進行指紋圖譜和整體質量評價研究較少［5-6］。指紋圖譜通過對化學成分群的整體反映，可全面、準確評價北蒼術藥材的內在質量。同時，網絡藥理學的應用為北蒼術內在機制及其整體研究提供思路，為預測其功效關聯物質及闡釋作用機制提供技術支持。

本研究建立北蒼術藥材指紋圖譜，并結合主成分分析確認引起北蒼術質量差異的主要成分，基于化學模式特征性地識別指紋圖譜的數據和變量，在此基礎上結合網絡藥理學分析北蒼術的功效關聯物質及作用機制，以期全面控制和評價北蒼術藥材質量。

1 材料

LC2030 型液相色譜儀、AUW 120D 分析天平（日本島津公司）；FA1004B 電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；KQ3200E 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

蒼術素對照品（批號111924-201806），購于中國食品藥品檢定研究院；綠原酸（批號110753-202018）、β-桉葉醇（批號P24O8F46474）、蒼術酮（批號P11M10F73437）對照品均購于上海源葉生物科技有限公司。磷酸、乙腈為色譜純；甲醇為分析純；水為超純水。

本實驗收集吉林、河北、內蒙等地北蒼術藥材22 批，經長春中醫藥大學翁麗麗教授鑒定為菊科植物北蒼術Atractylodes chinensis（DC.）Koidz.的干燥根莖，藥材信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法

2.1 指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脫（0～10 min，15% A；10～20 min，15%～30%A；20～30 min，30%～45%A；30～40 min，45%～55%A；40～65 min，55%～55%A；65～75 min，55%～70% A；75～100 min，70%～90% A）；體積流量1 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長208 nm（55～70 min）、220 nm（81～100 min）、304 nm（0～55、70～81 min）；進樣量10 μL。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取綠原酸、β-桉葉醇、蒼術素、蒼術酮適量，加甲醇溶解，制成質量濃度為0.018 6、0.016 0、0.005 0、0.012 4 mg／mL 的混合對照品溶液，備用。

2.1.3 供試品溶液制備 北蒼術藥材粉碎過3 號篩，取0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）1 h，放冷，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2 主成分分析 使用SPSS 22.0 軟件，以22 批北蒼術的共有峰峰面積為變量，進行主成分分析（主成分因子篩選標準，λ＞1），在盡可能保留原有信息量的前提下，降維分析起主導作用的重要成分，以此反映出決定類別的關鍵因素。

2.3 網絡藥理學分析

2.3.1 候選成分靶點預測及“成分-靶點” 網絡的構建 在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）檢索預測成分的化合物，獲取北蒼術候選成分的靶點信息；在PubChem Compound 數據庫搜索北蒼術預測成分化合物的SMILES 結構，通過Swiss Target Prediction 服務器進行北蒼術候選成分的靶點預測。

2.3.2 蛋白質互作網絡構建 利用STRING 11.0數據庫將“2.3.1” 項下篩選出的靶點進行PPI 分析，設置物種為“Homo sapiens”，蛋白交互參數評分值為“high confidence＞0.7”，獲得核心靶點PPI網絡圖，并導入Cytoscape3.7.2 軟件進行相關信息獲得和結構優化。

2.3.3 GO 功能富集 對“2.3.1” 項下獲得的作用靶點利用DAVID 6.8 數據庫進行GO 富集分析。以P＜0.05 進行篩選，并根據P值從小到大排序獲取GO 條目。

2.3.4 KEGG 通路富集 利用DAVID 6.8 數據庫對“2.3.1” 項下獲得的核心靶點進行KEGG 通路富集分析，P值越小，顯著性越強。將P值由小到大排序，利用微生物繪圖平臺（http：／ ／www.bioinformatics.com.cn／）將信號通路可視化。

2.3.5 “成分-靶點-通路” 網絡構建通過Cytoscape3.7.2 軟件，將北蒼術成分、靶點、信號通路相互作用的相關數據制成“成分-靶點-通路”網絡圖。

3 結果

3.1 HPLC 指紋圖譜分析

3.1.1 參照峰的選擇 在北蒼術藥材的指紋圖譜中，蒼術素的色譜峰分離度符合要求、峰面積和保留時間適中，且為所有樣品的共有峰之一，因此選擇蒼術素為參照峰。

3.1.2 方法學考察 按“2.1.1” 項下色譜條件進行精密度、重復性、穩定性考察，取同一北蒼術供試品溶液（批號CZ-1），以14 號峰（蒼術素）為參照峰，記錄各色譜圖，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD，結果均＜3.0%，表明儀器精密度、方法重復性、供試品溶液在24 h內穩定性均良好［7］。

3.1.3 HPLC 指紋圖譜的建立 取22 批北蒼術藥材，按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，記錄色譜圖，利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”，參照圖譜為S1 號樣品的HPLC 色譜圖，時間窗寬度為0.1 min，多點校正法匹配22 批北蒼術藥材的全譜峰，平均數法生成北蒼術藥材的對照圖譜，指紋圖譜疊加圖見圖1。22 批北蒼術標定18 個共有峰，見圖2。通過與對照品（圖3）圖譜比對，3 號峰為綠原酸，13 號峰為β-桉葉醇，14號峰為蒼術素，17 號峰為蒼術酮。相似度評價結果顯示，22 批北蒼術藥材的指紋圖譜相似度良好，其中18 批藥材的相似度大于0.9，說明所選不同產地的北蒼術藥材指紋圖譜較穩定。

圖1 22 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of twenty-two batches of samples

圖2 HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms

圖3 對照品HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of references

3.2 主成分分析 由表2 可知，5 個主成分被提取，累計方差貢獻率達到87.78%，圖4 輔助判斷5 個主成分因子應該被提取，表明提取出的5 個主成分可以代表北蒼術樣品的大部分信息內容，可用于評價北蒼術質量。由表3 可知，第1 主成分反映指紋圖譜中1、4、5、8、12、13、17 號峰信息，共有峰峰面積的變化可反映樣品共有峰的整體變化，表明樣品中13（β-桉葉醇）、17（蒼術酮）號共有峰對應成分的含量變化是導致藥材質量差異的重要因素；第2 主成分主要反映6、14（蒼術素）、15 號峰的信息；第3 主成分主要反映3（綠原酸）、9、11、18 號峰信息，3 個主成分可以反映88.89%的共有峰信息。以3 個主成分為變量得到載荷圖，見圖5，且β-桉葉醇（峰13）有較大的權重值，說明其在22 批北蒼術藥材中比較穩定，對主成分的貢獻率最大，在決定不同批次間北蒼術藥材質量差異上起到重要作用。

圖5 主成分因子載荷圖Fig.5 Load diagram of principal component factor

表3 初始因子載荷矩陣Tab.3 Initial factor load matrix

圖4 22 批北蒼術碎石圖Fig.4 Scree plot of 22 batches of A.chinensis

表2 特征值和累計方差貢獻率Tab.2 Eigenvalue and cumulative variance contribution rate

3.3 網絡藥理學分析

3.3.1 候選成分靶點預測及“成分-靶點” 網絡的構建 獲取預測的北蒼術功效關聯物質蒼術素、β-桉葉醇、蒼術酮的靶點信息后篩去重復靶點，最終得到53 個關聯靶點；通過Cytoscape 3.7.2 軟件將蒼術素、β-桉葉醇、蒼術酮構建網絡圖，見圖6。

圖6 “成分-靶點” 網絡圖Fig.6 Network diagramof component-target

3.3.2 PPI 構建與分析 將篩選出的53 個靶點導入STRING 11.0 數據庫，核心靶點繪制的PPI 網絡圖見圖7。通過Cytoscape 3.7.2 拓撲特征分析PPI 網絡圖，核心靶點篩選條件為度中心性和中介中心性參數均大于中位數且度值≥3，共得到15 個靶點，結果見表4。

表4 關鍵靶點篩選結果Tab.4 Results of key targets screening

圖7 PPI 網絡Fig.7 PPI network

3.3.3 GO 功能富集分析 利用DAVID 數據庫篩選得到GO 條目包含BP（生物過程）、CC（細胞組成）、MF（分子功能）條目，分別為79、31、40個，占比52.7%，20.7%，26.7%。設置P＜0.05，FDR＜0.05，根據P值由小到大排序，取前10 條通路，可視化分析得到圖8。生物過程主要涉及細胞對雌激素刺激的反應、乳腺腺泡發育、調節平滑肌收縮、疼痛反應、星形膠質細胞活化、細胞對鉀離子的反應等；細胞組成主要涉及軸膜、胞外區、薄膜、心臟肌原纖維、神經肌肉接頭、突觸、樹突骨架、高爾基體膜等；分子功能主要涉及氧化還原酶活力、生長因子蛋白結合、肌鈣蛋白I 結合、小蛋白激活酶結合等。

圖8 GO 功能分析Fig.8 GO function analysis

3.3.4 KEGG 通路富集分析 共得到12 條信號通路，結果見表5，可視化分析結果見圖9。

表5 靶點富集分析Tab.5 Enrichment analysis of target

圖9 KEGG 分析Fig.9 KEGG analysis

3.3.5 “成分-靶點-通路” 網絡構建及分析 根據Cytoscape3.7.2 軟件對網絡圖進行分析，以連接度為參考，預測蒼術素、β-桉葉醇、蒼術酮是北蒼術藥材發揮功效的重要基礎。北蒼術發揮利尿、抗炎以及抗癌等藥理活性與這些成分關系密切［8］。

由圖10 可知，連接度較高的靶點PSEN2、APH1B、PSEN1 等在癌癥的發生、發展，體內正常代謝以及阿爾茲海默病中起重要作用，體現在激素調節、腫瘤細胞增殖、凋亡、分化、侵襲、基因變異等生物過程中［9-13］，因此分析其可能是北蒼術藥材發揮作用的關鍵靶點。其 中，PSEN2、APH1B、PSEN1、APH1A、NCSTN、PSENEN 等是引起阿爾茲海默氏病關鍵因素γ-分泌酶的組件蛋白［14］。細胞色素P450 氧化代謝酶系是參與化療藥物代謝過程的關鍵酶，與多數抗腫瘤藥物的生物轉化、代謝消除密切相關［15］。組織蛋白酶CTSB、CTSL、CTSS 等是溶酶體蛋白中激活自噬所需最多的蛋白酶，主要與應激條件下周期長、結構大的蛋白質和細胞器的降解有關［16］。連接度較高的甾體激素生物合成通路、凋亡通路、溶酶體通路、阿爾茨海默病通路、Notch 信號通路是北蒼術發揮治療阿爾茲海默病及其他神經系統疾病、腫瘤癌變、心腦血管疾病的關鍵調控通路［17-20］。“成分-靶點-通路” 網絡的構建，說明北蒼術符合中藥多成分、多靶點和多途徑協同作用的典型特點。

圖10 “成分-靶點-通路” 網絡圖Fig.10 Network diagram of composition-target-pathway

4 討論

本研究首先對北蒼術化學成分進行表征，通過HPLC 分析建立北蒼術藥材的指紋圖譜，相似度評價良好，18 個共有峰得到確認，并對其中4 個色譜峰（綠原酸、β-桉葉醇、蒼術素、蒼術酮）進行指認；方法學考察精密度、穩定性和重復性良好（RSD＜3.0%），表明此方法準確可靠，可作為北蒼術藥材定性鑒別和質量評價的依據。

在22 批藥材指紋圖譜相似度分析中，18 批樣品相似度高于0.90。PCA 結果分析，β-桉葉醇、蒼術酮落在第1 主成分，蒼術素落在第2 主成分，綠原酸落在第3 主成分，說明β-桉葉醇、蒼術素、蒼術酮在決定不同批次間北蒼術藥材質量差異上作用重大。其中，綠原酸不是蒼術屬植物的代表性成分［21］。因此，指紋圖譜方法、化學模式識別與成分藥效相結合，可以確定北蒼術藥材含量測定指標為蒼術素、β-桉葉醇、蒼術酮，指標選擇更合理，能更科學、全面地反映藥材質量，可作為北蒼術藥材質量標準提升的重要依據。

采用網絡藥理學方法對北蒼術中蒼術素、β-桉葉醇、蒼術酮進行藥效成分篩選與靶點預測，發現其主要作用于PSEN2、APH1B、PSEN1、UGT2B7、SLC6A4、CTSB 等15 個關鍵靶點，通過甾體激素生物合成信號通路、Notch 信號通路、溶酶體通路、凋亡等信號通路發揮抑炎、抑菌、抗病毒等作用。“成分-靶點-通路” 網絡的構建為預測北蒼術的功效關聯物質提供依據，同時為闡釋北蒼術發揮燥濕健脾、抗菌消炎等傳統功效的作用機制提供思路［22］。蒼術素是通過PKA-SERCA2a 通路發揮增加心肌細胞鈣釋放的幅值正性肌力作用，與KEGG富集得到的心肌收縮通路具有一定的相關性［23］；蒼術酮具有一定的體內抗腫瘤效應，主要體現在上皮-間充質轉化過程的抑制和減少肝癌細胞的轉移和增長，通過凋亡途徑促進肝癌細胞的凋亡［24］；β-桉葉醇可能通過調控細胞周期和凋亡相關信號通路發揮抑制內皮細胞血管新生的作用［25］。

綜上所述，蒼術素、β-桉葉醇、蒼術酮可作為北蒼術的功效關聯物質，后期可利用分子對接技術進一步驗證分析。